Мультиплексный анализ изображений штрих-кодирования для иммунопрофилирования и пространственного картирования при одноклеточном анализе образцов парафиновой ткани

Большой объем биологической информации, полученной в результате мультиплексного анализа изображений штрих-кодирования, позволяет ученым лучше понять микроокружение опухоли и ее особое распределение внутри опухолевых клеток. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он дает нам гораздо более подробную информацию из того же образца ткани с возможностью более глубокого фенотипирования отдельных клеток. Этот метод позволил настраиваемым панелям изучать микроокружение опухоли, чтобы потенциально обнаружить прогностический биомаркер в раковой ткани для использования в качестве нового целевого лечения.

Чтобы начать окрашивание олигонуклеотидными конъюгированными антителами, замочите покровные листы в 0,1% растворе поли-L-лизина на 24 часа при комнатной температуре, чтобы подготовить их к размещению в ткани и адгезии. После слива раствора поли-L-лизина промойте покровные стекла сверхчистой водой в течение 30 секунд. После стирки снимите покровные листы из сверхчистой воды и положите их на безворсовое полотенце, чтобы они высохли на ночь.

Поместите интересующие срезы ткани толщиной 5 микрон в центр покровного стекла, заряженного поли-L-лизином, и дайте им высохнуть в течение ночи. Разогрейте держатель крышки в духовке при температуре 60 градусов Цельсия на ночь. Поместите защитный лист с тканевыми срезами в предварительно нагретый держатель.

После запекания при температуре 60 градусов Цельсия в течение 30 минут убедитесь, что парафин растаял на ткани. Быстро поместите держатель накладки, содержащий образец, последовательно в ряд растворов. Наконец, поместите держатель накладки в сверхчистую воду, обработанную DEPC, на два раунда по пять минут каждый.

Подготовьте камеру влажности, поместив пропитанное водой бумажное полотенце на дно пустой коробки для наконечников пипеток. Наполните скороварку водой, достаточной, чтобы покрыть половину высоты 50-миллилитрового стакана. Поместите 5 миллилитров метанола на образец в стакан при температуре 4 градуса Цельсия.

Разбавьте необходимый объем буфера AR9 до 1X диэтилпирокарбонатом или сверхчистой водой, обработанной DEPC. Затем заполните стеклянный стакан объемом 50 миллилитров примерно 40 миллилитрами разбавленного буфера AR9. Погрузите образец в держатель покровного стекла в стакан и полностью накройте стакан алюминиевой фольгой.

Поместите стакан, покрытый алюминиевой фольгой, в скороварку, наполненную водой, и готовьте при давлении около 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 20 минут. Затем снимите стакан и аккуратно разверните алюминиевую фольгу. Дайте стакану остыть при комнатной температуре около 10 минут.

Извлеките держатель накладки из буфера 1X AR9. Дважды инкубируйте его в сверхчистой воде, обработанной DEPC, в течение двух минут. Тем временем извлеките гидратационный буфер, разбавитель антител и блокирующие растворы N, G, J и S из набора для мультиплексного окрашивания изображений.

Поместите образец покровного стекла в 5 миллилитров гидратационного буфера дважды, по две минуты каждый. Затем поместите образец покровного стекла в 5 миллилитров мультиплексного блока разбавителя антител для визуализации и инкубируйте в течение 20-30 минут при комнатной температуре. Во время инкубации приготовьте коктейль антител.

После инкубации поместите покровное стекло в заранее подготовленную камеру влажности. Пипеткой нанесите 190 микролитров коктейля антител на образец покровного стекла и инкубируйте при комнатной температуре в течение трех часов. Затем промойте образец дважды, каждый с 5 миллилитрами мультиплексированного блока разбавителя антител для визуализации в течение двух минут.

Чтобы зафиксировать связанные антитела к ткани, инкубируйте покровные листы в течение 10 минут в 16%-ном формальдегиде, разбавленном до 1,6%-ного раствором для хранения, и трижды промойте их PBS. После инкубации крышку клеймят в течение пяти минут в метаноле, предварительно охладите до 4 градусов Цельсия. После стирки снова инкубируйте покровные листы в течение 20 минут в 5 миллилитрах фиксирующего реагента, разбавленного PBS, и трижды промойте их PBS перед хранением.

Подготовьте репортерский мастер-микс в соответствии с композицией, упомянутой в тексте. Заполните лунку в 96-луночном планшете 245 микролитрами раствора, содержащего репортерную мастер-смесь и специальные флуорофоры со штрих-кодом для этого экспериментального цикла. На рисунке показана конфигурация репортерной пластины, используемая здесь для панели карциномы.

Чтобы защитить флуорофоры со штрих-кодом, наклейте крышку фольгированной пластины на 96-луночную репортерную пластину и поместите пластину в мультиплексный прибор визуализации. Откалибруйте фокус изображения с помощью канала DAPI, поместив защитное стекло образца на столик микроскопа и вручную пипетировав 700 микролитров титрования раствора ядерного красителя в масштабе 1:1500 на ткань. Чтобы подготовить мультиплексированный прибор для визуализации, разбавьте 10-кратный мультиплексный буфер визуализации до 1-кратного с помощью сверхчистой воды, обработанной DEPC, и наполните бутылки с реагентами соответствующими растворами или растворителями.

Установите все параметры микроскопа и выберите интересующие области на бланке крышки образца для изображения. Введите экспериментальный проект в программное обеспечение диспетчера приборов. Нажмите кнопку «Эксперимент» в управляющей программе, а затем в окне «Настройка эксперимента и управление им» нажмите кнопку «Новый шаблон».

Введите имя проекта в поле рядом с кнопкой Проект и введите общее количество циклов. Нажмите кнопку «Назначение канала», введите информацию для каждого цикла в столбцы, такую как правильный цикл, номера скважин, места Z-стека, имя маркера, класс и время экспозиции для каждого цикла. Затем запустите эксперимент, нажав кнопку Начать эксперимент, и сохраните эксперимент.

Щелкните значок QuPath на компьютере и откройте программное обеспечение. Перетащите файл qptiff в окно просмотра. Нажмите кнопку яркости и контрастности, чтобы открыть окно «Контраст яркости».

Установите или снимите флажок с маркера в выбранном столбце, чтобы отобразить или скрыть сигнал маркера. Нажмите на кнопку масштабирования, чтобы увеличить или уменьшить масштаб интересующей области. При просмотре с помощью программного обеспечения для анализа изображений составные изображения отображали все маркеры или выбранные маркеры по желанию.

Выявлены интенсивность сигнала, динамический диапазон и пространственное распределение всех маркеров. Этот метод позволил проанализировать все 26 маркеров на субклеточном уровне в одном срезе ткани. Следуя процессу мультиплексного анализа изображений, с помощью информационных подходов можно обрабатывать и анализировать многомерные данные об отдельных клетках, чтобы сделать вывод о биологическом и клиническом понимании.

Мультиплексирующий анализ изображений штрих-кодирования — это мощная методология, которая позволяет ученым профилировать опухолевую ткань и отвечать на свои исследовательские вопросы в соответствии с маркерами на панелях.