Быстрое развитие схем идентификации состояния клеток с помощью политрансфекции
February 24th, 2023
Сложные генетические схемы требуют много времени для проектирования, тестирования и оптимизации. Чтобы облегчить этот процесс, клетки млекопитающих трансфицируются таким образом, чтобы можно было тестировать несколько стехиометрий компонентов схемы в одной лунке. В этом протоколе описаны этапы планирования экспериментов, трансфекции и анализа данных.
Наш протокол упрощает и ускоряет понимание взаимосвязей между биологическими частями. Мы можем проверить поведение многих метрических комбинаций деталей в одной скважине. Этот метод позволяет исследователям более всесторонне охарактеризовать сложные взаимосвязи между компонентами схемы с большей экспериментальной эффективностью, чем традиционные подходы.
Этот метод применим для синтетической биологии и для любых биологических вопросов, исследуя поведенческие изменения в клетке в ответ на различные уровни трансфицированных генов, где выход может быть измерен с помощью проточной цитометрии. Начните подготовку пробирок для каждого агрегата ДНК, отложив в сторону 1,5-миллилитровые микроцентрифужные пробирки, помеченные как без контроля цвета, контроль mKO2, контроль TagBFP, неоново-зеленый контроль, контроль цвета, смесь политрансфекции один и смесь политрансфекции два. Добавьте 36 микролитров восстановленной сывороточной среды в контрольную камеру без цвета, контроль mKO2, контроль TagBFP, неоново-зеленый контроль и все пробирки контроля цвета, затем добавьте 18 микролитров восстановленной сыворотки в каждую политрансфекционную смесь одну и политрансфекционную смесь в две пробирки.
Затем добавьте 600 нанограммов плазмиды-наполнителя в пробирку без контроля цвета, 300 нанограммов mKO2 и 300 нанограммов плазмиды-наполнителя в цветную контрольную трубку mKO2 и добавьте 300 нанограммов TagBFP и 300 нанограммов плазмиды-наполнителя в пробирку для контроля цвета TagBFP. К контрольной трубке неоново-зеленого цвета добавьте 300 нанограммов конститутивного неоново-зеленого и 300 нанограммов плазмиды-наполнителя, затем добавьте 100 нанограммов каждого mKO2, TagBFP, составляющего неоново-зеленого и 300 нанограммов плазмиды-наполнителя ко всем цветным контрольным трубкам. К политрансфекционной смеси в одну пробирку добавляют 150 нанограммов мКО2, 75 нанограммов репортерной неоново-зеленой плазмиды и 75 нанограммов плазмиды-наполнителя.
К смеси политрансфекции из двух пробирок добавьте 150 нанограммов TagBFP, 75 нанограммов плазмиды L7Ae и 75 нанограммов плазмиды-наполнителя. После этого создайте мастер-смесь для трансфекции в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитра, объединив 216 микролитров восстановленной сывороточной среды с 9,48 микролитрами реагента для трансфекции. Хорошо перемешайте, пипеткой вверх и вниз, прежде чем отложить в сторону.
Добавьте 1,58 микролитра реагента-усилителя без контроля цвета, одного контроля цвета и всех пробирок контроля цвета и добавьте 79 микролитров реагента-усилителя в каждую пробирку смеси для политрансфекции. Смешайте каждую трубку по отдельности, энергично пипетируя. Добавьте 37,58 микролитров мастер-смеси для трансфекции в пробирки без контроля цвета, одноцветного контроля и все контрольные трубки цвета и энергично перемешайте.
Затем добавьте 18,79 микролитров смеси для трансфекции в каждую пробирку смеси для политрансфекции и хорошо перемешайте каждую пробирку с помощью энергичного пипетирования. Распределите смеси для трансфекции в лунки путем пипетирования 65,97 микролитров каждой смеси для трансфекции для контроля без цвета, одного цвета и всех цветов в соответствующие лунки, затем перенесите 32,98 микролитра смеси для политрансфекции один в лунку для политрансфекции и эффективно распределите комплексы, быстро, но осторожно вращая пластину в плотном положении, Нарисуйте узор вдоль плоской поверхности, затем наберите пипеткой 32,98 микролитра политрансфекции, смешайте два в одну и ту же лунку для политрансфекции и закрутите пластину таким же образом. Инкубируют клетки в течение двух суток.
Проведите проточную цитометрию, чтобы считывать флуоресценцию маркеров трансфекции и выходной репортер для каждой клетки. Хорошо выполненная совместная трансфекция, отличная от политрансфекции, показанной на видео, показывает тесную корреляцию между TagBFP и EYFP, экспрессирующими плазмиды, которые были доставлены совместно. Напротив, плохо выполненная котрансфекция показывает плохую корреляцию между двумя плазмидами.
Хорошо выполненная политрансфекция показала хороший охват двумерного пространства и хорошую компенсацию любого спектрального кровотечения между флуоресцентными белками. Данные политрансфекции с небольшим количеством живых клеток было трудно разделить на достаточное количество ячеек с достаточным количеством клеток в каждой ячейке для анализа. Политрансфекция с низкой эффективностью трансфекции привела к разреженному охвату двумерного пространства для анализа.
Эффективное соотношение ДНК на выходной экспрессии было проверено путем помещения белка-репрессора L7Ae с mKO2 и выходного белка, неоново-зеленого с TagBFP, в отдельные смеси для трансфекции. Затем экспрессию неонового зеленого цвета контролировали на разных уровнях mKO2 и TagBFP. Результаты котрансфекции и политрансфекции сравнивались для этой схемы.
Результаты 11 отдельных совместных трансфекций, которые объединили части ДНК, показанные ранее, были собраны в единый набор данных и сравнены с данными политрансфекции. Сравнение кривых доза-реакция L7Ae, подавляющего выходной репортер, показало, что медианный выходной уровень на ячейку был очень похож между данными о совместной трансфекции и политрансфекции. Было продемонстрировано успешное применение политрансфекции для оптимизации классификатора типов клеток.
Микро-РНК-21, присутствующая в клетках HeLa и не-HEK-клетках, подавляет экспрессию BM3R1, поскольку BM3R1 подавляет выработку выходного сигнала схемы mKO2. Когда микро-РНК 21 присутствует в клетке, экспрессия mKO2 включается. Количество Gal4-VP16 настраивает экспрессию mKO2 на низких уровнях BM3R1.
Каждый компонент схемы был доставлен вместе с другим флуоресцентным маркером. Эта политрансфекция количественно определяет, сколько каждого компонента цепи получила каждая ячейка. mKO2 продуцируется в MIR21, продуцируя клетки HeLa, но не в клетках HEK.
Выход mKO2 был проанализирован после доставки этих компонентов схемы в отдельных трансфекционных смесях с различными флуоресцентными репортерами, чтобы указать количество каждого компонента схемы, полученного конкретной ячейкой. Эта подвыборка предсказала, что при таком соотношении котрансфицированная цепь имела 91% специфичности, 62% чувствительности и 77% точности при классификации HEK293 по сравнению с клетками HeLa. Наиболее распространенной болевой точкой в этом протоколе является отсутствие тесной корреляции внутри каждой смеси трансфекции.
Поэтому не забывайте энергично перемешивать трубки для трансфекции сразу после добавления реагента-усилителя, а затем будьте осторожны с перемешиванием и пипетированием трубок для трансфекции после добавления смеси для трансфекции, содержащей липиды. Этот метод быстро развил генетические схемы, такие как классификаторы клеток, контроллеры обратной связи и прямой связи, бистабильные мотивы и многое другое.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Этот протокол упрощает разработку и тестирование сложных генетических схем, позволяя проверить несколько стехиометрических составов компонентов схемы в одной пробирке. Исследователи могут эффективно охарактеризовать взаимоотношения между биологическими частями и их поведение в ответ на различные уровни трансфектированных генов.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Синтетическая биология
- Генетическая инженерия
- Клеточная биология
Предыстория
- Сложные генетические схемы сложны в разработке и оптимизации.
- Конвенциональные методы часто требовательны во времени и менее эффективны.
- Флюороцитометрия может измерить выход трансфектированных генов.
- Этот протокол нацелен на повышение экспериментальной эффективности.
Цель исследования
- Обеспечить проверку нескольких компонентов генетических схем.
- Улучшить понимание взаимоотношений биологических частей.
- Обеспечить всестороннюю характеристику поведения схем.
Используемые методы
- Трансфекция млекопитающих клеток с различными агрегатами ДНК.
- Приготовление микроцентрифугальных пробирок для различных контролов и смесей.
- Использование среды с пониженным содержанием сыворотки для оптимальных условий трансфекции.
- Измерение выходов с помощью флюороцитометрии.
Основные результаты
- Эффективное тестирование нескольких стехиометрических составов в одной пробирке.
- Улучшенное понимание сложных взаимоотношений между компонентами.
- Большая экспериментальная эффективность по сравнению с традиционными методами.
- Применимость к различным биологическим вопросам.
Выводы
- Этот метод упрощает разработку и тестирование генетических схем.
- Он позволяет более всесторонний анализ поведения схем.
- Исследователи могут эффективно исследовать влияние различных уровней генов.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Poly-transfection enables rapid, high-throughput optimization of mammalian genetic circuits by allowing simultaneous testing of multiple DNA stoichiometries in a single well. This approach accelerates the design-build-test cycle for cell state identification circuits, supporting predictive confidence and functional target validation in early discovery. The method streamlines portfolio triage by providing robust quantitative data for complex synthetic biology applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive interrogation of genetic circuit component relationships in mammalian cells.
- Supports functional de-risking and target validation by quantifying circuit behavior across diverse stoichiometries.
- Facilitates rapid hypothesis testing for cell classifier and regulatory motif development.
- Provides actionable data for prioritizing circuit designs with optimal specificity and sensitivity.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cell-based systems for downstream screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative outputs via flow cytometry for robust assay standardization.
- Enables high-throughput evaluation of circuit performance in a single-pot format.
- Supports scalable optimization of multi-component genetic constructs for screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cell state identification circuits with disease-relevant biomarkers for translational continuity.
- Provides quantitative specificity, sensitivity, and accuracy metrics for preclinical model selection.
- Reduces mechanistic ambiguity in circuit-driven cell classification and functional readouts.
- Supports risk-adjusted advancement of synthetic biology assets into preclinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
Poly-transfection integrates at the interface of early discovery and lead identification, enabling rapid optimization of genetic circuits for downstream translational and preclinical workflows.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway clarification by mapping circuit output to DNA input ratios.
- Screening: Provides reproducible, quantitative flow cytometry data for assay readiness and platform reuse.
- Analytics: Enables binning and statistical comparison of circuit performance across multiple conditions in a single experiment.
- Translational Research: Supports alignment of circuit outputs with disease-relevant cell states and biomarkers.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, generalizable workflow for rapid optimization of diverse genetic circuits.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in genetic circuit optimization.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable transfection and analysis workflows.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of synthetic biology assets for further development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, transfection, and flow cytometry analysis.
- Demands access to high-throughput flow cytometry and robust data analytics infrastructure.
- Necessitates rigorous mixing and pipetting protocols to ensure reproducibility across transfection mixes.
- May require adaptation of fluorescent markers and circuit components for different cell types or model systems.
- Dependent on sufficient transfection efficiency and live cell numbers for robust statistical analysis.
