Генерация функциональных эндодермальных органоидов печени

Наши исследования направлены на разработку актуальных для человека моделей печени in vitro для тестирования эффективности и безопасности лекарств, точно имитируя здоровые и больные ткани печени в доклинических исследованиях. Воспроизведение всей сложности печени, достижение долгосрочной функциональности, стандартизация протоколов и масштабирование производства органоидов для высокопроизводительных приложений остаются основной экспериментальной задачей в исследованиях органоидов. Недавно мы смоделировали фиброз печени из здоровых органоидов печени и создали модели редких заболеваний печени, включая цитруллинемию и дефицит пируваткарбоксилазы, из клеток, полученных от пациентов. В отличие от других методов, наш протокол eHEPO обеспечивает быстрое и масштабное получение функциональных органоидов печени, поддерживая долгосрочную функциональность и множественные анализы из одной стабильной исходной популяции.

[Рассказчик] Для начала добавьте 6 миллилитров холодного DMEM/F-12 в 15-миллилитровую коническую трубку. Сразу же добавьте в трубку 80 микролитров матрицы базальной мембраны FOD или BMM и хорошо перемешайте. Нанесите на обработанную тканевой культурой луночную пластину раствором BMM и распределите раствор для покрытия поверхности луночной пластины. Инкубируйте планшет в инкубаторе при температуре 37° Цельсия не менее одного часа. Возьмите индуцируемые плюрипотентные стволовые клетки или планшет IPSC и аспирируйте среду, специфичную для IPSC. Промойте планшет с помощью DMEM/F-12 или DPBS и добавьте 1 миллилитр специфического фермента в одну лунку 6-луночного планшета. После инкубации в течение одной минуты аспирируйте фермент и инкубируйте планшет при температуре 37° Цельсия в течение пяти-семи минут. Затем добавьте 1 миллилитр предварительно подогретой среды IPSC на пластину и осторожно постучите по стороне, чтобы отделить недифференцированные агрегаты колоний от поверхности пластины. Аккуратно перемешайте суспензию с помощью серологической пипетки объемом 5 миллилитров, а затем высадите клеточную суспензию нужной плотности на лунку, покрытую BMM. Инкубируйте клетки при температуре 37° Цельсия в течение трех-пяти дней, чтобы достичь конфлюенции 70%. Перед началом дифференцировки замените среду IPSC на среду для энтодермы. После дифференцировки клетки приобретают остроконечную форму, что указывает на межклеточное взаимодействие. Промойте клетки энтодермы PBS. Добавьте 300 микролитров трипсина. И инкубировать клетки в течение пяти минут в инкубаторе. Добавьте 3 миллилитра холодного DMEM/F-12 в ячейки и пипетку с фильтрующими наконечниками объемом 1000 микролитров, чтобы получить отдельные клетки. Соберите клеточную суспензию в 15-миллилитровую коническую пробирку и центрифугируйте клетки при 300 х г в течение пяти минут при комнатной температуре. После удаления надосадочной жидкости промойте гранулу 10 миллилитрами буфера FACS. Чтобы получить суспензию для одной клетки, отфильтруйте клетки с помощью сетчатого фильтра толщиной 100 микрометров, а затем с помощью сетчатого фильтра с ячейками 40 микрометров, а затем центрифугируйте клеточную суспензию в течение пяти минут. Ресуспендируйте 15 миллионов клеток 105 микролитрами буфера FACS и добавьте в суспензию 45 микролитров FcR и 15 микролитров EpCAM. Инкубируйте клетки в течение 10 минут при температуре 4° Цельсия, защищая трубку от света. Затем добавьте 500 микролитров буфера FACS для промывания клеточной суспензии. После центрифугирования клеток повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах буфера FACS и добавьте 0,5 микромоля на миллилитр DAPI в клеточную суспензию для количественного определения мертвых клеток. После сортировки клеток центрифугируйте клетки при давлении 300 x g в течение пяти минут. Удалите надосадочную жидкость. И ресуспендировать от 3000 до 5000 клеток в 20 микролитрах BMM. Засейте клетки, добавив каплю BMM в центр каждого 48-луночного планшета, и инкубируйте клетки в течение двух минут при температуре 37° Цельсия, пока BMM не затвердеет. Наложите на каплю расширительную среду. Чтобы расщепить органоидную каплю, выбросьте органоидную среду и добавьте в лунку 500 микролитров холодного Ad-DMEM/F-12. Используйте фильтрующие наконечники объемом 1000 микролитров для энергичного пипетирования капель BMM. Соберите максимум 10 капель BMM в 15-миллилитровые конические пробирки и добавьте 5 миллилитров холодного Ad-DMEM/F-12. Поместите трубку на лед на три-пять минут. Центрифугируйте клетки при 200 х г в течение пяти минут при 4° Цельсия и выбросьте надосадочную жидкость до тех пор, пока не останется 1 миллилитр надосадочной жидкости. Энергично пипетируйте клеточную гранулу от 30 до 40 раз, используя фильтрующие наконечники объемом 200 микролитров. После механической диссоциации добавьте 5 миллилитров холодного Ad-DMEM/F-12 перед центрифугированием клеток в течение пяти минут. Выбросьте надосадочную жидкость. И поместите подвеску на лед. Посейте семена 50-микролитровой капелькой BMM. И добавляем в расширяющую среду 25 нанограмм на миллилитр BMP7. После культивирования в течение трех дней замените среду средой для дифференцировки и культивируйте клетки в течение не менее 14 дней. Был проведен иммуноокрашивающий анализ, чтобы подтвердить, относятся ли органоиды, происходящие из клеток EpCAM+, к печеночной линии. Наличие клеток CK19+ и HNF4ɑ+ указывает на то, что в органоидах присутствуют гепатобласты и клетки-предшественники желчных протоков. Кроме того, органоиды, экспрессирующие маркеры эпителиальной ткани, такие как клетки E-CAD+ и кубические или полиэдральные эпителиальные клетки, экспрессирующие ZO-1, указывают на наличие плотных соединений между клетками. Иммуногистохимия показала, что клетки E-CAD+ демонстрируют полигональную эпителоидную структуру, отражающую гепатоцитоподобный фенотип. Здесь представлены изображения eHEPO, полученные в просвечивающей электронной микроскопии. Белыми кругами обозначены межклеточные соединительные комплексы. Черные стрелки показывают апикальную дифференциацию поверхности. А красной стрелкой показан поперечный срез микроворсинок. Анализ количественной ПЦР показал, что органоиды получили зрелые маркеры гепатоцитов, такие как ALB, A1AT, CYP3A4 и CYP3A7. Окрашенный в розовый цвет участок при окрашивании PAS указывает на способность органоидов накапливать гликоген. Кроме того, наш анализ показал способность органоидов выделять ALB в питательных средах, выводить аммиак из питательных сред, активность фермента CYP3A4 и транспортную способность желчных кислот.