Генерация мышей-нокаутов, специфичных для бурого жира, с использованием комбинированной системы однонаправленной РНК Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 и аденоассоциированной вирусной РНК
24 марта 2023 г.
В этом протоколе мы описываем технические процедуры для создания мышей-нокаутов, специфичных для бурой жировой ткани (BAT), с использованием комбинированной системы однонаправляющей РНК (sgRNA) Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 и аденоассоциированного вируса (AAV). Описанные этапы включают проектирование сгРНК, подготовку частиц AAV-sgRNA и микроинъекцию AAV в доли BAT.
Этот протокол генерирует мышей с нокаутом, специфичных для коричневого жира, с использованием системы однонаправленной РНК Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 и аденоассоциированного вируса. Он включает в себя хирургическую технику для безопасного введения AAV в бурый жир. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он может быстро генерировать тканеспецифические нокауты без необходимости селективного разведения мышей.
Подход к созданию тканоспецифического нокаута или нокдаунов может быть адаптирован к другим тканям, если хирургическая процедура инъекции AAV модифицируется в зависимости от органа-мишени. Для начала введите анальгетик подкожно анестезированной мыши UCP1 Cre Cas9, чтобы свести к минимуму и предотвратить послеоперационную боль и дистресс. Затем сбрейте мех в межлопаточной области с помощью бритвы и стерилизуйте операционную область не менее чем тремя чередующимися раундами скраба на основе йода или хлоргексидина, а затем 70% этанола.
С помощью скальпеля сделайте двухсантиметровый разрез на коже над бурой жировой тканью между лопатками, чтобы обнажить межлопаточный жир. Сделав один разрез, разрежьте жировые ткани на границе между дистальным отделом жировых тканей и мышцами. Затем, используя хирургические ножницы в доминирующей руке, отклейте жировые ткани тупо и вертикально, чтобы обнажить коричневую жировую ткань, одновременно зажимая жировые ткани, включая коричневую жировую ткань, недоминантной рукой.
Используйте вену Sulzer в качестве ориентира, чтобы указать точное расположение коричневой жировой ткани. Затем для каждой мыши медленно вводите 20 микролитров аденоассоциированного вируса или AAV в каждую долю двух коричневых жировых тканей с помощью острой иглы 32 калибра, соединенной со шприцем Гамильтона объемом 100 микролитров. Подтвердите успешную инъекцию, о чем свидетельствует отсутствие утечек из места инъекции во время введения AAV.
После обеспечения гомеостаза поместите открытые жировые ткани обратно в их нормальное положение, чтобы сшить край жировых тканей и мышц с помощью рассасывающейся монофиламентной нити 5-0. Наконец, зашите открытую кожу неокрашенными плетеными нитями VICRYL с покрытием 5-0. Точное местоположение бурой жировой ткани не может быть идентифицировано без ее обнажения, однако чрезмерное воздействие повреждает ткани.
Потенциальные недостатки, которые могли привести к неудачным инъекциям, включали введение раствора AAV в неправильную область, проникновение иглы через ткань и раздувание ткани из-за чрезмерного объема раствора AAV. Точная доставка однонаправляющей РНК AAV в бурую жировую ткань имела решающее значение для успеха протокола. Ключом к успеху при обнажении коричневой жировой ткани является техника хирургических ножниц, включая направление и глубину ножниц, а также расположение шприца Гамильтона.
Этот метод имеет ткано-специфических нокаутирующих животных, генерирующих нагрузку, чтобы понять молекулярные регуляторы энергетического обмена, связанного с бурым жиром.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается метод создания мышей с нокаутом, специфичным для бурой жировой ткани (БЖТ), с использованием комбинации систем Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 и техник доставки одноцепочечной направляющей РНК с помощью аденоассоциированного вируса (AAV). Использование этих методов позволяет исследователям быстро создавать тканеспецифичные нокауты без необходимости проведения селективного разведения.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Генетика
- Клеточная биология
- Молекулярная биология
Теоретическая справка
- Бурая жировая ткань имеет решающее значение для энергетического обмена.
- Создание тканеспецифичных нокаутов помогает в понимании биологических процессов.
- Данный метод потенциально может быть адаптирован для других тканей.
Используемые методы
- Применение подходов Cre-LoxP и CRISPR-Cas9.
- Используемая модель мышей: мыши UCP1 Cre Cas9.
- Введение AAV-sgRNA посредством хирургической микроинъекции.
Основные результаты
- Успешное таргетирование и нокаут бурой жировой ткани.
- Продемонстрированная эффективность AAV в тканеспецифичном редактировании генов.
- Валидированные основные хирургические методы для прецизионного введения.
Выводы
- В исследовании представлен экспресс-метод создания нокаутных моделей, имеющих значение для изучения метаболизма бурого жира.
- Работа расширяет понимание молекулярных регуляторов энергетического обмена.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для отрасли
Быстрое создание мышей с тканеспецифическим нокаутом в бурой жировой ткани (БЖТ) с использованием комбинированных технологий Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 и AAV-sgRNA позволяет ускорить функциональную геномику в метаболических исследованиях. Данный подход оптимизирует валидацию мишеней и снижение механистических рисков для генов, участвующих в регуляции энергообмена, сокращая время цикла по сравнению с традиционным скрещиванием. Этот метод способствует принятию решений по портфелю исследований, предоставляя критически важные данные о тканеспецифичности, необходимые для раннего поиска и обеспечения трансляционной преемственности.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет напрямую исследовать функции генов в БУР для уточнения механизмов действия.
- Способствует снижению биологических рисков путем изоляции эффектов генов в ткани, имеющей значение для заболевания.
- Повышает прогностическую уверенность при выборе мишеней для лечения метаболических нарушений.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает валидированные нокаут-модели для последующего фенотипического скрининга.
- Стандартизирует генетический фон для получения воспроизводимых количественных показателей.
- Ускоряет разработку методов анализа, позволяя избежать длительных циклов скрещивания.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит доклинические модели в соответствие с механизмами метаболических заболеваний человека с помощью редактирования генов, специфичного для бурой жировой ткани (BAT).
- Обеспечивает продвижение с учетом рисков за счет уточнения вклада конкретных генов в энергетический обмен.
- Поддерживает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации в метаболических исследованиях.
Интеграция в конвейеры и рабочие процессы
Данный метод применяется на ранних стадиях поиска и валидации мишеней, обеспечивая переход к разработке доклинических моделей для исследовательских портфелей в области метаболических и эндокринных нарушений.
- Открывающая биология: Поддерживает проверку гипотез и выяснение путей в регуляции энергетического обмена, опосредованной BAT.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые модели нокаута для количественного фенотипического анализа.
- Аналитика: Позволяет измерять ген-специфические эффекты на метаболические показатели in vivo.
- Трансляционные исследования: Способствует приведению доклинических моделей в соответствие с биологией BAT человека.
- Корпоративное повторное использование: Адаптивный протокол для других тканей путем модификации доставки AAV, что расширяет возможности применения в области НИОКР.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней.
- Операционная ценность: оптимизирует создание моделей за счет стандартизированных и воспроизводимых процедур.
- Стратегическая ценность: позволяет быстрее принимать решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективно распределять ресурсы.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритезацию метаболических и эндокринных мишеней с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области хирургической микроинъекции и анатомической локализации BAT.
- Необходим доступ к инфраструктуре по производству AAV и генетической инженерии CRISPR-Cas9.
- Требуется строгая стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости.
- Для воздействия на другие ткани или органы необходима адаптация протокола.
- Успех зависит от точности доставки AAV и минимизации повреждения тканей.
