Выделение, культивирование и характеристика первичных дермальных фибробластов из келоидной ткани человека
28 июля 2023 г.
В этом исследовании описывается оптимизированный протокол создания первичных фибробластов из келоидных тканей, которые могут эффективно и стабильно обеспечивать чистые и жизнеспособные фибробласты.
Выделение и культивирование первичных фибробластов, полученных из келоидной ткани, являются основой для дальнейших исследований келоидов. Фибробласты из келоидной ткани могут быть легко получены с помощью этого протокола, что может обеспечить обильный и стабильный источник клеток в лаборатории для исследования келоидов. Начните с использования стерильного пинцета, чтобы поместить келоидную ткань в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров, содержащую от 10 до 25 миллилитров PBS с добавлением 1% PSA.
Тем временем добавьте четыре миллилитра раствора PBS PSA в каждую лунку шестилуночного планшета. Теперь выньте ткань из тюбика и дважды промойте раствором PBS PSA. С помощью стерильных щипцов последовательно перенесите ткань из одной лунки в другую.
Затем хирургическими ножницами удаляют жировой слой и слой эпидермиса, оставляя дерму нетронутой. С помощью ножниц рассеките подстриженную дерму на кусочки размером от трех до пяти квадратных миллиметров и перенесите кусочки в следующую лунку с помощью стерильных щипцов. Вымойте кусочки в растворе PBS PSA.
Стерилизованными щипцами поместите от 10 до 30 кусочков ткани дермы на расстоянии менее пяти миллиметров друг от друга в чашки Петри. Поставьте посуду вверх дном в инкубатор, пока кусочки не высохнут и не прилипнут к блюду. Далее добавляют семь миллилитров ДМЭМ с добавлением 10%ФБС и 1%ПСА и инкубируют блюда, как и раньше.
Через трое суток замените половину надосадочной жидкости полной питательной средой. Ежедневно наблюдайте за фибробластами под 40-кратным микроскопическим увеличением. Удалите кусочки ткани в питательной среде, когда фибробласты достигнут 90% слияния.
Промойте фибробласты в PBS и добавьте два миллилитра стерильного раствора трипсина ЭДТА. После инкубации клеток в увлажненном инкубаторе осторожно постучите по чашке с культурой и понаблюдайте за ней под микроскопом. Добавьте два миллилитра полной среды, чтобы закончить пищеварение, как только большая часть клеток отделится.
Теперь перенесите клеточную суспензию в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте пробирку при 300 г в течение трех минут при комнатной температуре. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в полной среде. Засейте фибробласты в девятисантиметровую чашку для клеточных культур и инкубируйте в увлажненном инкубаторе.
Для проведения иммунофлуоресцентного анализа после культивирования фибробластов на круглых покровных стеклах и инкубации их в первичных и вторичных антителах добавляют 50 микролитров раствора DAPI к предметному стеклу для окрашивания клеточных ядер. Поместите вымытые покровные стекла на предметные стекла с помощью щипцов. Наконец, перенесите образцы во влажный темный ящик для флуоресцентной микроскопии.
Фибробластные разрастания ткани наблюдались через пять суток после обработки. Фибробласты показали высокую скорость пролиферации и достигли слияния через 10 дней. Фибробласты имели удлиненные и веретенообразные клеточные тела, которые были выровнены в пучки при высокой слиянии.
Иммунофлуоресцентное окрашивание дало положительную красную иммунофлюоресценцию фибробластов и синюю иммунофлюоресценцию клеточного ядра. Проточные цитометрические анализы показали положительность CD90 почти во всех фибробластах. В этом исследовании описан оптимизированный метод и даны четкие инструкции для решения существующих проблем и повышения шансов на успех при выделении и культивировании келоидных фибробластов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании описывается оптимизированный протокол выделения первичных фибробластов из тканей келоидных рубцов, который позволяет эффективно и стабильно получать чистые и жизнеспособные фибробласты. Изоляция и культивирование этих фибробластов имеют важное значение для развития исследований келоидов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Культивирование клеток
- Изоляция фибробластов
- Исследование келоидов
Теоретическая часть
- Келоиды представляют собой аномальные рубцы, изучение которых может быть затруднительным.
- Первичные фибробласты имеют решающее значение для понимания биологии келоидов.
- Существующие протоколы могут не обеспечивать достаточную жизнеспособность клеток.
- Данное исследование направлено на совершенствование процесса изоляции.
Цель исследования
- Разработать надежный метод выделения фибробластов из тканей келоидов.
- Обеспечить стабильный источник фибробластов для лабораторных исследований.
- Углубить понимание механизмов формирования келоидов и методов их лечения.
Используемые методы
- Использование стерильных пинцетов и центрифужных пробирок для работы с тканью.
- Промывание ткани келоида в PBS с добавлением 1% PSA.
- Последовательный перенос ткани между лунками шестилуночного планшета.
- Создание условий культивирования для роста фибробластов.
Основные результаты
- Успешное выделение жизнеспособных фибробластов из тканей келоидов.
- Протокол обеспечивает получение достаточного количества клеток для исследований.
- Фибробласты сохраняли стабильность и жизнеспособность с течением времени.
- Метод способствовал дальнейшему изучению биологии келоидов.
Выводы
- Оптимизированный протокол эффективен для выделения фибробластов.
- Обеспечивает основу для дальнейших исследований келоидов.
- Расширяет возможности для терапевтического прогресса в лечении келоидов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Надежное выделение и культивирование первичных дермальных фибробластов из тканей келоида удовлетворяют критическую потребность в релевантных клеточных моделях заболевания для ранних этапов поиска лекарственных средств. Данный протокол обеспечивает стабильный доступ к чистым, валидированным популяциям фибробластов, что способствует проведению механистических исследований и валидации мишеней при фиброзных заболеваниях кожи. Этот подход повышает прогностическую достоверность и трансляционную преемственность при проверке терапевтических гипотез в рамках исследовательских портфелей по изучению келоидов.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать пути развития фибробластов, вовлеченные в патогенез келоидов.
- Снижает биологические риски за счет предоставления функционально валидированных первичных клеток.
- Облегчает проведение механистических исследований для уточнения значимости мишеней при фиброзных заболеваниях.
- Повышает прогностическую уверенность при принятии решений по ранней сортировке портфеля проектов.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает воспроизводимый источник первичных фибробластов для стандартизации анализа.
- Позволяет разрабатывать количественные клеточные методы анализа для оценки соединений.
- Поддерживает воспроизводимость и масштабируемость в рабочих процессах скрининга.
- Снижает вариабельность за счет минимизации контаминации и примеси клеток, не являющихся фибробластами.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит модели in vitro в соответствие с типами человеческих клеток, имеющими значение для заболевания, для проведения трансляционных исследований.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации в исследованиях келоидов.
- Поддерживает продвижение кандидатов в антифибротические препараты с учетом оценки рисков.
- Предоставляет платформу для поиска и валидации биомаркеров при условии подтверждения в последующих исследованиях.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол представляет метод выделения первичных фибробластов келоидов как связующее звено между стадией раннего поиска и доклиническими исследованиями, что позволяет проводить надежную валидацию мишеней и разработку анализов для исследовательских программ по изучению фиброзных заболеваний кожи.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез и уточнению путей патогенеза келоидов.
- Скрининг: обеспечивает валидированные, воспроизводимые клеточные системы для разработки количественных методов анализа.
- Аналитика: позволяет проводить характеристику с помощью иммунофлуоресценции и проточной цитометрии для подтверждения идентичности клеток.
- Трансляционные исследования: предоставляет релевантные заболеванию клеточные модели для доклинической оценки потенциальных терапевтических препаратов.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает стандартизированный протокол, который может быть адаптирован различными исследовательскими группами и проектами.
Влияние на операционную деятельность и предприятие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и уменьшает механистическую неопределенность в исследованиях келоидов.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость рабочих процессов с первичными клетками.
- Стратегическая ценность: повышает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), а также эффективность использования капитала в программах на ранних стадиях.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию с учетом рисков и продвижение антифибротических активов.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы со стерильными тканями и методами первичного культивирования клеток.
- Необходим доступ к помещениям для культивирования клеток, оборудованию для иммунофлуоресценции и проточной цитометрии.
- Требуется стандартизация между группами исследователей для обеспечения воспроизводимости изоляции и характеризации клеток.
- Может потребоваться адаптация метода для других источников фиброзной или дермальной ткани.
- Потенциальные ограничения включают вариабельность доноров и доступность тканей.
