В естественных условиях Визуализация всего мозга личинок рыбок данио-рерио с использованием трехмерной флуоресцентной микроскопии
28 апреля 2023 г.
Здесь представлен протокол визуализации всего мозга личинок рыбок данио-рерио in vivo с использованием трехмерной флуоресцентной микроскопии. Экспериментальная процедура включает в себя подготовку образцов, получение изображений и визуализацию.
Мы разрабатываем оптические иммунные системы и вычислительные алгоритмы для регистрации и анализа нейроактивности всего мозга с высоким пространственным и временным разрешением. Лабораторная рыба является идеальным модельным животным для исследований. Благодаря каждой оптической прозрачности и наличию разнообразных генетических инструментов качество оптического изображения может ухудшиться из-за аберрации, вносимой агарозным гелем, используемым для монтажа образца, и рыба может двигаться во время записи, вызывая артефакты движения на изображениях или препятствуя извлечению сигнала точности из изображений.
Общедоступные протоколы предоставляют лишь краткий обзор экспериментальной процедуры, затрагивая существенные детали детали, такие как затвердевание агарозы, точные методы монтажа и простое позиционирование. Поэтому для получения высококачественных данных изображения необходим эффективный и воспроизводимый протокол. С минимальным шумом и движением.
Наш протокол обеспечивает оптимизированную и воспроизводимую экспериментальную процедуру. Этот протокол позволяет in vivo визуализировать весь мозг в течение длительного периода времени и визуализировать полученные данные визуализации. Рабочий процесс был сосредоточен на визуализации всего мозга, но его можно легко применить для визуализации других органов многих наших рыб-зебр.
Наша цель состоит в том, чтобы разгадать основные принципы нейронных вычислений. Для этого мы продолжим работу над конвейером, который включает в себя крупномасштабную визуализацию нейронной активности и структуры, а также вычислительный анализ для систематического картирования мозга.
Обзор
В данной статье представлен подробный протокол прижизненной визуализации всего мозга личинок zebrafish с использованием трехмерной флуоресцентной микроскопии. Модель zebrafish предпочтительна благодаря ее оптической прозрачности и генетической доступности для изучения нейронных вычислений и активности. В протоколе рассматриваются такие распространенные проблемы, как артефакты движения и аберрации агарозного геля, что обеспечивает получение высококачественных данных изображений.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биофизика
- Методы визуализации
Теоретические сведения
- Личинки данио-рерио являются важной моделью для изучения нейронной активности благодаря своей прозрачности.
- К основным трудностям относятся аберрации, вызванные агарозным гелем, и артефакты движения при визуализации.
- В современных протоколах отсутствуют подробные инструкции по эффективному закреплению и позиционированию образцов.
- Визуализация с высоким разрешением имеет критическое значение для понимания принципов нейронных вычислений.
Цель исследования
- Разработать воспроизводимый протокол высококачественной визуализации активности мозга zebrafish.
- Снизить уровень шума и количество двигательных артефактов во время сеансов визуализации.
- Облегчить изучение нейронных вычислений в течение длительных периодов времени.
Используемые методы
- Основной используемой платформой является трехмерная флуоресцентная микроскопия.
- В качестве биологической модели используются личинки zebrafish, подготовленные и иммобилизованные для визуализации.
- Для минимизации появления артефактов внедрен оптимизированный рабочий процесс эксперимента.
- Критически важными этапами являются точное позиционирование zebrafish и правильная настройка параметров визуализации.
- Визуализация полученных данных осуществляется с помощью программных инструментов, таких как napari.
Основные результаты
- Протокол визуализации позволяет детально осмотреть области мозга, включая нейронные структуры переднего, среднего и заднего мозга.
- Нейронную активность можно зарегистрировать с помощью серии изображений во времени, что дает важные сведения о функциях нейронов.
- Четкая видимость всех областей мозга свидетельствует об эффективности данного протокола.
Выводы
- Данное исследование демонстрирует новый подход к визуализации, который углубляет понимание нейронной активности Danio rerio.
- Представленный протокол не только устанавливает стандарт визуализации Danio rerio, но и имеет значение для более широких нейробиологических исследований.
- Ожидается, что дальнейшее развитие конвейеров обработки изображений позволит улучшить картирование мозга и исследования нейронных вычислений.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Трехмерная флуоресцентная визуализация мозга личинок zebrafish позволяет проводить высокоразрешающее картирование структуры и активности нейронов in vivo, что способствует открытиям в области нейронаук на ранних этапах. Данный протокол направлен на обеспечение воспроизводимости и снижение количества артефактов, создавая надежную основу для механистического анализа рисков и валидации мишеней в нейробиологических исследованиях. Его адаптивность и количественные результаты делают этот метод применимым в рамках корпоративных циклов НИОКР, ориентированных на анализ нейронных цепей и функциональный скрининг.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает систематическое исследование нейронных путей и клеточной активности на модели позвоночных.
- Снижает биологические риски за счет минимизации артефактов движения и aberраций при визуализации.
- Повышает прогностическую достоверность идентификации нейронных мишеней благодаря количественным данным по всему мозгу.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подготовить валидированные иммобилизованные образцы zebrafish для воспроизводимых рабочих процессов визуализации.
- Стандартизирует параметры визуализации и позиционирование образцов для обеспечения согласованности анализа.
- Позволяет получать количественные волюметрические данные и данные временных рядов, пригодные для последующего анализа и скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Предоставляет релевантную для заболевания систему на позвоночных для функционального картирования нейронных цепей.
- Обеспечивает непрерывный переход от поисковой визуализации к разработке доклинических моделей для нейроактивных соединений.
- Поддерживает оптимизацию рисков при продвижении исследований за счет получения высокоинформативных и воспроизводимых данных визуализации.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол визуализации интегрирован в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, что позволяет проводить проверку гипотез, картирование путей и количественный анализ на моделях нейробиологии позвоночных.
- Открывающая биология: Обеспечивает основанное на гипотезах картирование нейронной активности и структуры с клеточным разрешением.
- Скрининг: Позволяет получать воспроизводимые количественные результаты визуализации для исследований воздействия химических соединений или генетических модификаций.
- Аналитика: Предоставляет объемные и временные наборы данных для вычислительного анализа и сравнения различных условий.
- Трансляционные исследования: Соответствует задачам разработки доклинических моделей, обеспечивая функциональную визуализацию в системе позвоночных.
- Корпоративное повторное использование: Протокол может быть адаптирован для визуализации других органов или систем личинок zebrafish, что поддерживает масштабируемость платформы.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации нейронных мишеней.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость и стандартизацию экспериментов по визуализации.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность распределения капитала в портфелях нейробиологических исследований.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию нейронных мишеней и функциональных анализов с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с данио-рерио (zebrafish), их иммобилизации и флуоресцентной микроскопии.
- Необходим доступ к конфокальным или специализированным платформам для флуоресцентной визуализации, а также к инструментам компьютерного анализа.
- Требуется межкомандная стандартизация подготовки образцов и параметров визуализации.
- Метод применим к другим органам личинок данио-рерио, но может потребовать оптимизации протокола для различных тканей.
- Потенциальные ограничения включают артефакты визуализации, вызванные агарозой, и смещение изображения при неполной иммобилизации.
