Псевдоостровковая система человека для синхронной оценки динамики флуоресцентных биосенсоров и секреторных профилей гормонов
3 ноября 2023 г.
В этом протоколе описан метод синхронного сбора и совместной регистрации внутриклеточных сигнальных событий и секреции инсулина и глюкагона первичными псевдоостровками человека с использованием аденовирусной доставки циклического биосенсора аденозинмонофосфата (цАМФ), детектора разности цАМФ in situ (cADDis) и микроперифузионной системы.
Наша лаборатория работает над изучением, предотвращением и обращением вспять дисфункции бета-клеток и других аномалий век при диабете первого и второго типа. Наши исследования сосредоточены на патогенезе диабета человека, объединяя исследования биологии поджелудочной железы и век человека, а также здоровья и болезней. Человеческие глазки представляют собой сферические трехмерные структуры, и доступ к клеткам по всей длине глаза представляет собой некоторые экспериментальные проблемы.
Например, при попытке внедрить биосенсоры для понимания передачи сигналов клетками глазков, наш протокол псевдовек преодолевает эту проблему, выполняя генетические манипуляции в состоянии одной клетки и агрегируя эти трансдуцированные клетки глаз человека в псевдовеки для последующих исследований. Наша псевдосистема век позволяет нам экспрессировать биосенсоры по всему глазу, а не только по поверхности века. В сочетании с нашей системой визуализации живых клеток и системой микроперфузии мы можем измерять и регистрировать динамические внутриклеточные процессы с последующей секрецией гормонов.
Этот протокол может быть применен для ответа на целый ряд важных научных вопросов. Например, стратегии подавления экспрессии генов могут быть объединены с этим подходом, чтобы понять влияние интересующего гена на функцию век и связанные с ней сигнальные пути, как глобально, так и индивидуально.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной работе рассматриваются дисфункция бета-клеток и аномалии островков при диабете с использованием модельной системы псевдоостровков для синхронной регистрации клеточной сигнализации и секреции гормонов. Метод предполагает аденовирусную доставку биосенсора цАМФ и использование системы микроперфузии для динамического анализа ответов инсулина и глюкагона.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Сахарный диабет 1-го и 2-го типа
- Биология островков человека
- Динамика клеточной сигнализации
Введение
- Островки человека представляют собой сферические структуры, создающие определенные трудности при проведении экспериментов.
- Протокол создания псевдоостровков позволяет решить эти проблемы для эффективного внедрения биосенсоров.
- Понимание механизмов передачи сигналов в островках имеет решающее значение для исследований диабета.
Используемые методы
- Аденовирусная доставка для экспрессии биосенсоров
- Модель первичных псевдоостровков человека
- Система микроперфузии для измерения секреции гормонов
Основные результаты
- Успешная совместная регистрация внутриклеточной сигнализации и высвобождения гормонов.
- Возможность анализа влияния сайленсинга генов на функцию островков.
- Динамический мониторинг секреторных ответов в режиме реального времени.
Выводы
- Данное исследование представляет собой надежный протокол для изучения гормональной сигнализации островков.
- Оно имеет важное значение для понимания биологии островков при диабете.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Система человеческих псевдоостровков позволяет проводить синхронную количественную оценку внутриклеточной сигнализации и секреции гормонов в первичных клетках островков человека, устраняя критический барьер в валидации мишеней при диабете. Обеспечивая возможность генетических манипуляций и интеграции биосенсоров во всей 3D-структуре островков, эта платформа повышает прогностическую достоверность механистических исследований и поддерживает принятие решений по портфелю проектов с учетом рисков в области изучения метаболических заболеваний. Интеграция методов визуализации живых клеток и микроперфузионных рабочих процессов делает её многоразовым инструментом для раннего поиска и трансляционных исследовательских конвейеров.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Позволяет проверять терапевтические гипотезы, связывая внутриклеточную сигнализацию с секрецией гормонов в клетках островков человека.
- Способствует снижению биологических рисков за счет подавления экспрессии генов или выяснения путей с помощью биосенсоров в физиологически релевантном 3D-контексте.
- Обеспечивает прогностическую уверенность и функциональную валидацию мишеней для программ по изучению диабета и метаболических заболеваний.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных систем псевдоостровков для последующего скрининга соединений и анализа механизмов действия.
- Стандартизация условий анализа для воспроизводимого количественного измерения секреции гормонов и динамики биосенсоров.
- Обеспечение возможности масштабируемой мультиплексной оценки потенциальных терапевтических средств на релевантной модели человека.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет результаты исследований in vitro с биологией островков человека, имеющей значение для патологии, для разработки трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации, позволяя снизить механистические риски при работе с первичными тканями человека.
- Поддерживает принятие взвешенных решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков путем интеграции функциональных показателей и данных о сигнальных путях.
Интеграция в конвейеры и рабочие процессы
Данная система связывает этапы первичного поиска, валидации мишеней и доклинических исследований, обеспечивая возможность проверки гипотез путем анализа сигналинга и функции островков в рамках единого рабочего процесса.
- Открывающая биология: Поддерживает проверку механистических гипотез и уточнение путей передачи сигналов посредством синхронного считывания показателей биосенсоров и гормонов.
- Скрининг: Обеспечивает создание готовых к анализу, воспроизводимых моделей псевдоостровков для количественной оценки воздействий.
- Аналитика: Позволяет проводить динамические количественные измерения сигнализации cAMP и секреции гормонов для надежного сравнения условий.
- Трансляционные исследования: Связывает полученные in vitro данные о механизмах с биологией заболеваний человека, способствуя согласованию биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: Предлагает стандартизированную, адаптируемую платформу для многократного использования в программах по изучению метаболических заболеваний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней для лечения диабета.
- Операционная ценность: Улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость функциональных анализов островков.
- Стратегическая ценность: Повышает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет интеграции функциональных и сигнальных данных.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию и продвижение активов по лечению метаболических заболеваний с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области изоляции островков человека, генетических манипуляций и визуализации живых клеток.
- Необходим доступ к конфокальной микроскопии, системам микроперфузии и количественному анализу гормонов.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов приготовления псевдоостровков и проведения анализов.
- Может потребоваться адаптация для различных донорских источников или моделей заболеваний.
- Пропускная способность и масштабируемость ограничены доступностью первичных тканей и технической сложностью.
