Генерация и манипуляции с органоидами кишечника крыс
23 июня 2023 г.
Здесь мы представляем протокол для создания органоидов кишечника крыс и использования их в нескольких последующих приложениях. Крысы часто являются предпочтительной доклинической моделью, а надежная система кишечных органоидов удовлетворяет потребность в системе in vitro для сопровождения исследований in vivo .
В этом исследовании мы создали модель органоида кишечника крысы, которая устойчива к долговременной клеточной культуре. Мы также демонстрируем первые успешные генетические манипуляции с использованием лентивирусной инфекции и транзиторной трансфекции. Эта модель является отличным инструментом для манипулирования биологией кишечника у крыс, где генетические инструменты, доступные in vivo, ограничены.
Органоиды кишечника крыс ранее было трудно культивировать в течение длительного времени. Создавая надежную, генетически манипулируемую органоидную модель крысы, мы предоставляем исследователям дополнительную гибкость и возможность выбора органоидной модели, наиболее подходящей для их конкретных обстоятельств. Органоиды кишечника мышей используются для изучения поведения, судьбы и физиологии стволовых клеток, но они могут быть неоптимальной моделью.
Так как между биологией мыши и человека есть ключевые различия. С другой стороны, органоиды кишечника человека может быть трудно получить, и они имеют сложные требования к культуре клеток. Модель органоида крысы, которую мы здесь описываем, сохраняет ключевое физиологическое значение для биологии человека, но при этом к ней значительно легче получить доступ и уход, чем кишечные органоиды человека.
Разработка и оптимизация модели органоида кишечника крысы позволяет проводить генетические манипуляции, фармакологическое лечение, а также проводить более высокопроизводительные исследования биологии кишечника и доступной модели, имеющей ключевое физиологическое значение для человека. Кроме того, эти органоиды крыс позволят изучать видоспецифическую физиологию, судьбу клеток, фенотипические вариации и модели заболеваний в кишечнике.
Обзор
В данной работе исследуется создание надежной модели кишечных органоидов крысы, подходящей для длительного культивирования клеток. Данная модель позволяет проводить генетические манипуляции и служит доступной системой in vitro для дальнейшего изучения биологии кишечника, имеющей значение для физиологии человека.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Биология кишечника
- Методы генетической манипуляции
- Доклинические модели
Теоретическая база
- Крысы являются предпочтительной доклинической моделью.
- Ранее существовали сложности в долгосрочном культивировании кишечных органоидов крыс.
- Существуют ключевые различия между биологией мыши и человека, которые могут повлиять на результаты исследований.
Используемые методы
- Лентивирусное заражение и транзиентная трансфекция для генетических модификаций.
- Кишечные органоиды крысы в качестве биологической системы.
- Методы культивирования клеток и диссекции для создания органоидов.
Основные результаты
- Успешное получение и поддержание жизнеспособности кишечных органоидов крысы.
- Демонстрация возможности генетических манипуляций с органоидами.
- Предоставление жизнеспособной альтернативы моделям органоидов мыши и человека для биологических исследований.
Выводы
- В данном исследовании представлена новая модель кишечных органоидов крысы, поддерживающая генетические манипуляции.
- Эта модель может значительно расширить исследования биологии кишечника, имеющие значение для человека.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Стабильные кишечные органоиды крыс позволяют биофармацевтическим группам исследовать биологию кишечника на модели, обладающей большей физиологической релевантностью по отношению к человеку, чем системы на мышах, оставаясь при этом более доступными, чем органоиды человеческого происхождения. Эта платформа поддерживает генетические манипуляции и высокопроизводительные исследования, восполняя критический пробел в моделировании заболеваний и валидации мишеней в исследованиях желудочно-кишечного тракта. Данная модель повышает прогностическую достоверность и трансляционную преемственность на ранних этапах поиска и в точках принятия решений на доклиническом этапе.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишеней
- Позволяет проводить функциональный анализ кишечных путей и механизмов определения клеточной судьбы в физиологически релевантной системе.
- Обеспечивает возможность генетических манипуляций для механистического снижения рисков и валидации мишеней в случаях, когда инструментарий для работы in vivo на крысах ограничен.
- Способствует проведению сравнительных исследований видоспецифической биологии кишечника для обоснования выбора и приоритизации мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированную воспроизводимую платформу для фармакологического тестирования и скрининга соединений.
- Поддерживает разработку функциональных анализов на набухание и количественных показателей для последующих этапов рабочих процессов.
- Позволяет подготавливать 2D-монослои и 3D-органоиды для различных форматов анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит доклинические модели в соответствие с физиологией кишечника человека для повышения трансляционной значимости.
- Позволяет исследовать специфические для заболевания фенотипы и ответы биомаркеров в масштабируемой системе in vitro.
- Связывает этап поиска и доклиническую валидацию, обеспечивая возможность генетического и фармакологического манипулирования в тканях, полученных из крыс.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данная платформа органоидов крыс применима на всех этапах — от ранних стадий поиска до доклинических исследований, обеспечивая поддержку проверки гипотез, валидации мишеней и трансляционных исследований.
- Открытия в биологии: способствует уточнению сигнальных путей и снижению биологических рисков с помощью генетических и функциональных анализов.
- Скрининг: обеспечивает получение воспроизводимых культур органоидов, готовых к анализу, для оценки соединений и фенотипического скрининга.
- Аналитика: предоставляет количественные результаты функциональных анализов и визуализации для надежного сравнения данных.
- Трансляционные исследования: поддерживает моделирование заболеваний и согласование биомаркеров в физиологически релевантной системе на крысах.
- Корпоративное повторное использование: предлагает гибкую, масштабируемую модель, адаптируемую к нескольким исследовательским программам и контекстам заболеваний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов и снижает неопределенность механизмов при валидации мишеней в кишечнике.
- Операционная ценность: Стандартизирует рабочие процессы и повышает воспроизводимость генетических и фармакологических исследований.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает более точный прием решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и эффективность использования капитала за счет приведения моделей в соответствие с биологией человека.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию с учетом рисков и продвижение программ по изучению желудочно-кишечного тракта.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами органоидов, генетическими манипуляциями и разработкой функциональных анализов.
- Необходим доступ к инфраструктуре для культивирования клеток, оборудованию для визуализации и инструментам молекулярной биологии.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости данных.
- Может потребоваться адаптация для различных отделов кишечника или моделей заболеваний.
- Для каждого применения следует подтвердить стабильность долгосрочного культивирования и масштабируемость.
