Генерация и манипуляции с органоидами кишечника крыс
23 июня 2023 г.
Здесь мы представляем протокол для создания органоидов кишечника крыс и использования их в нескольких последующих приложениях. Крысы часто являются предпочтительной доклинической моделью, а надежная система кишечных органоидов удовлетворяет потребность в системе in vitro для сопровождения исследований in vivo .
В этом исследовании мы создали модель органоида кишечника крысы, которая устойчива к долговременной клеточной культуре. Мы также демонстрируем первые успешные генетические манипуляции с использованием лентивирусной инфекции и транзиторной трансфекции. Эта модель является отличным инструментом для манипулирования биологией кишечника у крыс, где генетические инструменты, доступные in vivo, ограничены.
Органоиды кишечника крыс ранее было трудно культивировать в течение длительного времени. Создавая надежную, генетически манипулируемую органоидную модель крысы, мы предоставляем исследователям дополнительную гибкость и возможность выбора органоидной модели, наиболее подходящей для их конкретных обстоятельств. Органоиды кишечника мышей используются для изучения поведения, судьбы и физиологии стволовых клеток, но они могут быть неоптимальной моделью.
Так как между биологией мыши и человека есть ключевые различия. С другой стороны, органоиды кишечника человека может быть трудно получить, и они имеют сложные требования к культуре клеток. Модель органоида крысы, которую мы здесь описываем, сохраняет ключевое физиологическое значение для биологии человека, но при этом к ней значительно легче получить доступ и уход, чем кишечные органоиды человека.
Разработка и оптимизация модели органоида кишечника крысы позволяет проводить генетические манипуляции, фармакологическое лечение, а также проводить более высокопроизводительные исследования биологии кишечника и доступной модели, имеющей ключевое физиологическое значение для человека. Кроме того, эти органоиды крыс позволят изучать видоспецифическую физиологию, судьбу клеток, фенотипические вариации и модели заболеваний в кишечнике.
Обзор
В данном исследовании изучается создание надежной модели кишечных органоидов крысы, подходящей для длительного культивирования клеток. Эта модель облегчает проведение генетических манипуляций и служит доступной системой in vitro для дальнейшего изучения биологии кишечника в контексте физиологии человека.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Биология кишечника
- Методы генетических манипуляций
- Доклинические модели
Теоретические сведения
- Крысы являются предпочтительной доклинической моделью.
- Ранее возникали трудности при долгосрочном культивировании кишечных органоидов крыс.
- Существуют ключевые различия между биологией мыши и человека, которые могут влиять на результаты исследований.
Используемые методы
- Лентивирусное заражение и транзиентная трансфекция для генетических модификаций.
- Кишечные органоиды крысы в качестве биологической системы.
- Методы культивирования клеток и диссекции для получения органоидов.
Основные результаты
- Успешное получение и культивирование кишечных органоидов крысы.
- Демонстрация возможности генетических манипуляций с органоидами.
- Предоставление жизнеспособной альтернативы моделям органоидов мыши и человека для биологических исследований.
Выводы
- В данном исследовании представлена новая модель кишечных органоидов крысы, поддерживающая генетические манипуляции.
- Эта модель может значительно расширить возможности исследований биологии кишечника, имеющих значение для медицины человека.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Стабильные кишечные органоиды крыс позволяют биофармацевтическим группам исследовать биологию кишечника на модели, которая обладает большей физиологической релевантностью человеку, чем системы на мышах, оставаясь при этом более доступными, чем органоиды человеческого происхождения. Данная платформа поддерживает генетические манипуляции и высокопроизводительные исследования, восполняя критический пробел в моделировании заболеваний и валидации мишеней в исследованиях желудочно-кишечного тракта. Эта модель повышает прогностическую точность и трансляционную непрерывность на ранних этапах поиска и в точках принятия решений на доклиническом этапе.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишеней
- Позволяет проводить функциональный анализ кишечных путей и механизмов принятия решений о судьбе клеток в физиологически релевантной системе.
- Обеспечивает возможность генетических манипуляций для механизмического снижения рисков и валидации мишеней в случаях, когда инструменты для исследований in vivo на крысах ограничены.
- Облегчает проведение сравнительных исследований видоспецифичной биологии кишечника для обоснования выбора и приоритетности мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированную, воспроизводимую платформу для фармакологического тестирования и скрининга соединений.
- Поддерживает разработку функциональных тестов на набухание и количественные показатели для последующих этапов рабочего процесса.
- Позволяет подготавливать 2D-монослои и 3D-органоиды для различных форматов анализов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит доклинические модели в соответствие с физиологией кишечника человека для повышения трансляционной значимости.
- Позволяет исследовать специфические для заболевания фенотипы и ответы биомаркеров в масштабируемой системе in vitro.
- Связывает этапы поиска и доклинической валидации, обеспечивая возможность генетических и фармакологических манипуляций в тканях, полученных от крыс.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Эта платформа органоидов крысы применима на всех этапах — от ранних открытий до доклинических исследований, обеспечивая поддержку при проверке гипотез, валидации мишеней и трансляционных исследованиях.
- Открытия в биологии: способствует уточнению путей передачи сигнала и снижению биологических рисков с помощью генетических и функциональных анализов.
- Скрининг: обеспечивает получение воспроизводимых культур органоидов, готовых к анализу, для оценки соединений и фенотипического скрининга.
- Аналитика: предоставляет количественные данные функциональных анализов и визуализации для надежного сравнения данных.
- Трансляционные исследования: поддерживает моделирование заболеваний и подбор биомаркеров в физиологически релевантной системе на крысах.
- Корпоративное повторное использование: предлагает гибкую, масштабируемую модель, адаптируемую к нескольким исследовательским программам и различным контекстам заболеваний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации кишечных мишеней.
- Операционная ценность: Стандартизирует рабочие процессы и повышает воспроизводимость генетических и фармакологических исследований.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает более эффективный прием решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и оптимизацию использования капитала за счет приведения моделей в соответствие с биологией человека.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию с учетом рисков и продвижение программ по изучению желудочно-кишечного тракта.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт работы с культурами органоидов, генетическими манипуляциями и разработкой функциональных анализов.
- Необходим доступ к инфраструктуре для культивирования клеток, средствам визуализации и инструментам молекулярной биологии.
- Требуется стандартизация между группами исследователей для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости данных.
- Может потребоваться адаптация протокола для различных отделов кишечника или моделей заболеваний.
- Для каждого применения следует подтвердить стабильность длительного культивирования и возможность масштабирования.
