Визуализация ATG9A, многодиапазонного мембранного белка
16 июня 2023 г.
В этом протоколе описаны различные методы, которые могут помочь в изучении биологии ATG9A, включая иммунофлуоресценцию с последующим анализом изображений, рассмотрение вопросов транзиторной гиперэкспрессии и исследование статуса гликозилирования ATG9A с помощью вестерн-блоттинга.
В нашей лаборатории мы заинтересованы в понимании того, какие липиды и белковые механизмы участвуют в транспортировке везикул ATG9A. ATG9A имеет решающее значение в пути аутофагии для образования и созревания фагофоров. Тем не менее, недавно мы изучали влияние ATG9A на гомеостаз органелл.
Самая большая проблема заключается в том, чтобы раскрыть молекулярные детали того, как функционируют белки и белковые механизмы. Такие технологии, как белковая инженерия, основанная на AlphaFold и крио-ЭМ с высоким разрешением, в настоящее время обеспечивают наибольший прогресс. Работа моей лаборатории позволила получить фундаментальное представление о том, как формируются аутофагосомы.
Эти идеи были подкреплены передовыми методами молекулярной клеточной биологии, такими как описанная здесь. Описаны некоторые недостатки использования определенных белковых меток и то, как поведение ATG9A может меняться в зависимости от локализации метки. Таким образом, либо N, либо C-конец.
Мы также предлагаем способы обнаружения этих недостатков и способы их избежать. Кроме того, мы также обеспечиваем рабочий процесс количественной оценки дисперсии ATG9A воспроизводимым образом. Здесь мы обеспечиваем рабочий процесс от иммунофлуоресценции и визуализации в реальном времени до получения и анализа изображений для анализа рассеивания ATG9 между различными клеточными компартментами.
И мы считаем, что стандартизация конвейеров для анализа изображений является приоритетом для клеточных биологов, чтобы иметь возможность повысить надежность и воспроизводимость наших результатов.
Обзор
В данном исследовании изучаются механизмы транспорта везикул ATG9A и его роль в аутофагии и гомеостазе органелл. Используя клетки HEK293A, исследователи применили различные методы клеточной визуализации, чтобы понять влияние белковых меток на локализацию и поведение ATG9A.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Клеточная биология
- Аутофагия
- Транспорт белков
Теоретическая часть
- ATG9A играет ключевую роль в формировании фагофора при аутофагии.
- В исследовании рассматриваются сложности в понимании белковых механизмов, участвующих в везикулярном транспорте.
- Данные получены с помощью передовых молекулярных методов.
Используемые методы
- Иммунофлуоресцентный анализ и прижизненная визуализация конструктов ATG9A
- Линии клеток HEK293A
- Вестерн-блот-анализ и передовые методы микроскопии
Основные результаты
- Различные подходы к мечению влияют на поведение и локализацию ATG9A.
- Оверэкспрессированный ATG9A может колокализоваться с маркерами аппарата Гольджи в условиях питания.
- Исследование предлагает воспроизводимый рабочий процесс для анализа распределения ATG9A по клеточным компартментам.
Выводы
- Исследование подчеркивает важность точного мечения при изучении динамики белков.
- Полученные результаты способствуют более глубокому пониманию механизмов аутофагии и клеточного гомеостаза.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Точная визуализация и количественная оценка трафика ATG9A решают критически важную задачу по валидации мишеней аутофагии и механистическому снижению рисков для портфелей ранних стадий поиска лекарственных средств. Стандартизированные рабочие процессы локализации мембранных белков обеспечивают воспроизводимую оценку компонентов пути аутофагии, что повышает прогностическую достоверность в системах, имеющих значение для конкретных заболеваний. Эти возможности служат основой для принятия надежных решений о продолжении или прекращении программ, направленных на модуляцию аутофагии.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Ранний поиск и валидация мишеней
- Позволяет исследовать функцию ATG9A в инициации аутофагии и везикулярном транспорте.
- Способствует снижению биологических рисков за счет уточнения локализации белка и динамики его транспорта.
- Повышает прогностическую уверенность в связывании с мишенью и модуляции сигнального пути.
Скрининг и разработка анализа
- Предлагает стандартизированные рабочие процессы иммунофлуоресценции и прижизненной визуализации для анализа мембранных белков.
- Обеспечивает воспроизводимое количественное определение распределения белков по клеточным компартментам.
- Позволяет подготовить анализ для скрининга соединений, нацеленных на пути аутофагии.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет понимание механизмов с релевантными моделями гомеостаза органелл при заболеваниях.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации модуляторов аутофагии.
- Поддерживает продвижение проекта с учетом рисков за счет уточнения путей транспорта белков в физиологических условиях.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный рабочий процесс визуализации и количественного анализа позволяет использовать анализ трафика ATG9A на стыке этапов первичного поиска, валидации мишеней и доклинических исследований в рамках программ по изучению аутофагии.
- Биология открытий: обеспечивает проверку гипотез о роли ATG9A в формировании фагофоров и инициации аутофагии.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные показатели локализации и трафика белков.
- Аналитика: позволяет проводить статистическое сравнение меченых конструкций и паттернов трафика в различных условиях.
- Трансляционные исследования: обеспечивает механистическую преемственность для оценки модуляции аутофагии в моделях заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: создает стандартизированный масштабируемый конвейер визуализации для изучения мембранных белков.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней аутофагии.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и стандартизацию рабочих процессов, основанных на методах визуализации.
- Стратегическая ценность: Улучшает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала для портфелей, ориентированных на аутофагию.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию программ по воздействию на трафик мембранных белков с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области иммунофлуоресценции, прижизненной визуализации и количественного анализа изображений.
- Необходим доступ к конфокальной микроскопии и развитой аналитической инфраструктуре.
- Требуется межкомандная стандартизация стратегий мечения и протоколов визуализации.
- Необходимо учитывать влияние положения метки на локализацию и агрегацию белков.
- Практические ограничения включают возможные артефакты, вызванные гиперэкспрессией и индуцированной меткой мислокализацией.
