In Vitro Химическое картирование структур ДНК G-квадруплекса бис-3-хлорпиперидинами
12 мая 2023 г.
Бис-3-хлорпиперидины (B-CeP) являются полезными химическими зондами для идентификации и характеристики структур G-квадруплекса в матрицах ДНК in vitro. В этом протоколе подробно описана процедура проведения зондирующих реакций с B-CeP и растворения продуктов реакции с помощью электрофореза в полиакриламидном геле высокого разрешения.
G-квадруплексы — это вторичные структуры нуклеиновых кислот, которые обычно образуются в богатых гуанином последовательностях ДНК. Химическое картирование G4 с помощью B-CeP направлено на характеристику G4 in vitro и позволяет идентифицировать специфические гуанины, образующие G-тетрады. Идентификация и экспериментальная проверка G4 в потенциальных G-квадруплекс-образующих последовательностях является биологически значимой проблемой, которая в настоящее время решается в первую очередь с помощью вычислительных инструментов.
Для подтверждения таких предсказаний и обнаружения непредсказанного G4 химическое картирование с помощью B-CeP представляет собой доступный метод идентификации G4 в последовательностях ДНК. Химическое картирование с помощью B-CeP является удобной альтернативой широко используемому протоколу диметилсульфатного следа для характеризации G-квадруплекса. Ключевое преимущество B-CeP заключается в том, что он сокращает количество шагов в протоколе и уменьшает начальное количество субстрата ДНК.
Химическое картирование с помощью B-CeP описано здесь с последовательностью TBA в качестве доказательства концепции. Протокол приведет к новым экспериментам, применимым к любой другой потенциальной последовательности, образующей G-квадруплекс, изучающей конструкции как ДНК, так и РНК.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье рассматривается использование бис-3-хлорпиперидинов (B-CePs) в качестве химических зондов для идентификации и характеристики G-квадруплексных структур в ДНК. Описанный протокол представляет метод проведения реакций зондирования и разделения продуктов с помощью высокоразрешающего полиакриламидного гель-электрофореза.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биохимия
- Молекулярная биология
- Генетика
Теоретическая часть
- G-квадруплексы представляют собой вторичные структуры, образующиеся в богатых гуанином последовательностях ДНК.
- B-CePs позволяют проводить характеристику G-квадруплексов in vitro.
- Идентификация G-квадруплексов имеет решающее значение для понимания их биологической значимости.
- Химическое картирование с помощью B-CePs служит альтернативой традиционным методам, таким как диметилсульфатный футпринтинг.
Цель исследования
- Предоставить протокол использования B-CeP для исследования структур G-квадруплексов.
- Облегчить идентификацию конкретных гуанинов в G-тетрадах.
- Оптимизировать процесс характеристики G-квадруплексов.
Используемые методы
- Реакции зондирования с помощью бис-3-хлорпиперидинов (B-CePs).
- Полиакриламидный гель-электрофорез высокого разрешения для разделения продуктов.
- Методы химического картирования для идентификации G-квадруплексов.
- Сравнение с протоколами футпринтинга с использованием диметилсульфата.
Основные результаты
- B-CeP эффективно идентифицируют G-квадруплексные структуры в ДНК.
- Данный метод сокращает количество этапов и объем требуемого ДНК-субстрата.
- Экспериментальная валидация подтверждает результаты компьютерного предсказания G-квадруплексов.
- Данный протокол повышает доступность исследований G-квадруплексов для ученых.
Выводы
- B-CeP являются ценным инструментом для исследования G-квадруплексов.
- Данный протокол упрощает идентификацию и характеристику G-квадруплексов.
- Этот метод может дать новое понимание биологической роли G-квадруплексов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Точное картирование структур G-квадруплексов (G4) ДНК имеет решающее значение для валидации мишеней в регуляции генов и путях, связанных с заболеваниями. Анализ химического картирования B-CeP позволяет напрямую идентифицировать гуанины, образующие G-тетрады, in vitro, что способствует снижению механистических рисков и повышению прогностической уверенности на ранних этапах поиска. Эта возможность оптимизирует оценку потенциальных терапевтических мишеней в богатых гуанином геномных областях, улучшая сортировку и приоритизацию портфеля препаратов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное исследование и валидация мишени
- Обеспечивает прямую экспериментальную валидацию структур G4 в потенциальных целевых последовательностях.
- Способствует механистическому снижению рисков за счет дифференциации свернутых G4 от несвернутых или альтернативных форм ДНК.
- Повышает достоверность прогнозов в отношении выявленных вычислительным путем PQS, предоставляя ортогональные химические доказательства.
- Уменьшает неопределенность при выборе мишеней для стратегий регуляции генов и модификации заболеваний.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подготавливать валидированные ДНК-субстраты, содержащие G4, для последующих этапов скрининга.
- Обеспечивает картирование с однонуклеотидным разрешением, что способствует стандартизации и воспроизводимости анализа.
- Позволяет проводить количественную оценку реакционной способности зондов и паттернов расщепления ДНК для надежной разработки метода анализа.
- Оптимизирует требования к образцам и этапы протокола по сравнению с традиционными методами футпринтинга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Согласуется с системами, имеющими отношение к заболеваниям, за счет картирования G4, участвующих в экспрессии генов и геномной стабильности.
- Обеспечивает непрерывность процесса от картирования на этапе поиска до валидации соединений, нацеленных на G4, в доклинических моделях.
- Поддерживает продвижение с учетом рисков путем выяснения структурной основы взаимодействия с мишенью.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод химического картирования применяется на стыке этапов раннего поиска и идентификации ведущих соединений, обеспечивая связь между компьютерным прогнозированием и экспериментальной валидацией мишеней G4.
- Открытие в биологии: подтверждает образование G4 и участие гуанина, что способствует проверке гипотез и уточнению путей взаимодействия.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые количественные данные картирования для обеспечения готовности анализа и оценки соединений.
- Аналитика: обеспечивает результаты ПААГ высокого разрешения для сравнительного анализа свернутых и несвернутых форм ДНК.
- Трансляционные исследования: позволяют картировать G4 в последовательностях, имеющих значение для заболеваний, что способствует согласованию биомаркеров, где это применимо.
- Корпоративное повторное использование: предлагает широко применимый масштабируемый протокол картирования для различных конструктов, содержащих PQS.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней G4.
- Операционная ценность: Упрощает рабочие процессы, снижает требования к количеству вводимой ДНК и повышает воспроизводимость.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет уточнения взаимосвязей «структура-функция» мишеней.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию программ, нацеленных на G4, с учетом рисков на всех этапах конвейера открытий.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области химии нуклеиновых кислот и анализа методом электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE) с высоким разрешением.
- Необходим доступ к химическим зондам (B-CePs) и оборудованию для визуализации гелей.
- Требуется стандартизация между командами для обеспечения воспроизводимости картирования и интерпретации данных.
- Метод применим как к ДНК-, так и к РНК-конструкциям с гуанин-богатыми последовательностями.
- Реакционная способность зонда может зависеть от состава буфера и присутствия нуклеофилов, что требует оптимизации протокола.
