Проектирование и создание настраиваемого однообъективного флуоресцентного микроскопа для визуализации сетей цитоскелета
26 января 2024 г.
В этом протоколе подробно описывается, как построить однообъективный флуоресцентный микроскоп со световым листом и как его использовать для визуализации сетей цитоскелета.
Наша работа направлена на углубление знаний о взаимосвязи между динамикой транс-работы, локальной структурой и механическими свойствами в материалах, далеких от равновесия. Визуализация далеких от равновесия материалов, таких как сети цитоскелетов, требует возможности получать изображения плотных, трехмерных образцов с сопоставимым качеством изображения по всему объему образца, нанося при этом минимальный ущерб за счет фотообесцвечивания, технически сложной задачи, для которой лучше всего подходит флуоресцентная световая микроскопия. Флуоресцентные световые микроскопы обеспечивают превосходные возможности оптического секционирования, что позволяет получать изображения этих толстых трехмерных образцов в течение длительного времени с минимальным фотообесцвечиванием.
В частности, система светового листа с одним объективом, которую мы представим, совместима с традиционными скользящими образцами, что делает ее очень универсальным инструментом. Подавляющее большинство однообъективных световодов написано для пользователей с большим опытом работы с оптикой. Чтобы сделать сложную настройку в стиле светового листа с одним объективом более доступной, в этом подробном руководстве описаны шаги, которые может выполнить пользователь с глубокими знаниями курса оптики начального уровня.
Обзор
Данное исследование направлено на углубление понимания динамики транс-работы в материалах, находящихся далеко от равновесного состояния, с особым вниманием к сетям цитоскелета. В работе подробно описываются конструкция и применение однообъективного светолистового флуоресцентного микроскопа для оптимальной визуализации таких плотных трехмерных образцов.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Клеточная биология
- Микроскопия
- Далеко от равновесия материалы
Теоретическая часть
- Трудности визуализации плотных трехмерных биологических образцов
- Важность минимизации фотообесцвечивания во время длительных сеансов визуализации
- Преимущества светолистowej микроскопии для получения оптических срезов
Используемые методы
- Сборка однообъективного светолисткового флуоресцентного микроскопа
- Использование тестовых образцов микротрубочек, меченных родамином
- Процедуры юстировки и калибровки для достижения оптимального качества изображения
Основные результаты
- Успешная визуализация сетей цитоскелета
- Демонстрация минимального повреждения образцов в процессе визуализации
- Эффективная визуализация на различных глубинах образца
Выводы
- В данном протоколе представлен практически реализуемый подход к визуализации сложных биологических структур
- Этот метод может оказать существенную помощь исследователям в изучении механически активных биологических материалов
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Визуализация плотных трехмерных сетей цитоскелета с высоким разрешением имеет решающее значение для раннего поиска и механистической оценки рисков при разработке лекарственных препаратов на основе клеточной биологии. Настраиваемый однообъективный светлопоточный флуоресцентный микроскоп (SOLS) обеспечивает воспроизводимую визуализацию сложных биологических ансамблей с низким уровнем фотовыцветания, что повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней и фенотипическом скрининге. Данное доступное оборудование устраняет разрыв между передовым методом оптического секционирования и практическими рабочими процессами НИОКР, оптимизируя принятие решений по портфелю проектов на критическом этапе разработки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает прямую визуализацию динамики цитоскелета в реконструированных модельных системах для проверки гипотез.
- Способствует снижению механистических рисков за счет высокоточного объемного имиджинга неравновесных биологических структур.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней с помощью количественных и воспроизводимых результатов визуализации.
Скрининг и разработка анализа
- Подготавливает валидированные трехмерные биологические системы для последующих рабочих процессов фенотипического скрининга.
- Предоставляет стандартизированные количественные данные оптического секционирования для обеспечения воспроизводимости анализа.
- Позволяет надежно оценивать влияние соединений на архитектуру цитоскелета в плотных образцах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет результаты визуализации с фенотипами цитоскелета, имеющими значение для заболевания в трансляционных моделях.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации, позволяя проводить надежные лонгитюдные исследования с помощью визуализации.
- Снижает риски при продвижении кандидатов путем уточнения биологических механизмов в сложных системах.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Микроскоп SOLS интегрируется в процесс от начальных открытий до доклинических исследований, обеспечивая количественную визуализацию 3D-моделей цитоскелета, что поддерживает как поиск гипотез, так и разработку масштабируемых методов анализа.
- Открытия в биологии: обеспечивает оптическое секционирование для проверки гипотез и уточнения путей в плотных биологических структурах.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые количественные результаты визуализации, подходящие для стандартизации анализа и скрининга соединений.
- Аналитика: генерирует волюметрические данные и данные таймлапс-съемки для сравнительного анализа экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: связывает фенотипы визуализации с механизмами развития заболеваний при применении к соответствующим моделям.
- Корпоративное повторное использование: модульная конструкция поддерживает адаптацию для различных биологических систем и исследовательских групп.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в исследованиях, направленных на цитоскелет.
- Операционная ценность: способствует стандартизации, воспроизводимости и масштабируемости рабочих процессов визуализации.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о целесообразности продолжения разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет обеспечения получения надежных данных с минимальным количеством артефактов.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение активов на стадии первичного поиска.
Особенности реализации
- Требуются базовые знания в области оптики и тщательная юстировка оптических компонентов.
- Необходим доступ к стандартному микроскопическому оборудованию и аналитическому программному обеспечению для обработки изображений.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости визуализации и интерпретации данных.
- Метод может быть адаптирован к различным модельным системам при условии соответствующей калибровки и подготовки образцов.
- Практические ограничения включают сложность юстировки и необходимость совместимости образцов с креплением на предметных стеклах.
