Скрининг модификации гистонов с использованием жидкостной хроматографии, спектрометрии подвижности захваченных ионов и времяпролетной масс-спектрометрии
12 января 2024 г.
Аналитический рабочий процесс, основанный на жидкостной хроматографии, спектрометрии подвижности захваченных ионов и времяпролетной масс-спектрометрии (LC-TIMS-ToF MS/MS) для высокодостоверного и высоковоспроизводимого анализа модификаций гистонов «снизу вверх» и идентификации на основе основных параметров (время удержания [RT], поперечное сечение столкновения [CCS] и точное отношение массы к заряду [m/z]).
Предложен метод с использованием протокола экстракции гистонов с эффективностью 95%. Вместе с LC-TIMS-ToF MS/MS можно за короткое время получить скрининг для тех ПТМ, которые присутствуют в гистоне. И, прежде всего, возможность разделения изомеров.
Разделение изомерных пептидов, хотя и возможно только с помощью тандемной масс-спектрометрии, часто затруднено. Используя TIMS, мы вводим дополнительное измерение разделения, упрощая идентификацию многих позиционных изомеров. Кроме того, пассивная технология повышает чувствительность этих экспериментов, что еще больше улучшает наши возможности по анализу эпигенетических вариаций.
С повышением способности идентифицировать позиции ПТМ появляется возможность дальнейшего определения корреляции между различными факторами окружающей среды или биологическими факторами и их влиянием на эпигеном. Методы, улучшающие и облегчающие анализ гистонов, могут быть применены в нескольких областях исследований, включая медицинскую химию и химию окружающей среды. Динамика подтверждения белка в нативном или поврежденном состояниях будет установлена при внедрении TIMS MS/MS с HDX.
С помощью LC-TIMS-ToF MS/MS и Nano LC-TIMS-ToF MS/MS будут отображены различия в PTM, существующие в различных биологических образцах.
Обзор
В данном исследовании представлен аналитический рабочий процесс с использованием жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии с захватом ионной мобильности и времяпролетной масс-спектрометрии (LC-TIMS-ToF MS/MS) для высокоточного анализа модификаций гистонов. Данный метод значительно повышает эффективность идентификации посттрансляционных модификаций (PTM) и их позиционных изомеров.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биохимия
- Эпигенетика
Теоретические сведения
- Гистоны играют ключевую роль в регуляции генов посредством различных модификаций.
- Идентификация этих модификаций необходима для понимания эпигенетических механизмов.
- Традиционные методы сталкиваются с трудностями при разделении изомеров.
- Интеграция TIMS обеспечивает новое измерение для более эффективного разделения.
Цель исследования
- Разработать метод эффективной экстракции и анализа гистонов.
- Улучшить идентификацию посттрансляционных модификаций (PTM) и их изомеров.
- Установить корреляцию между факторами окружающей среды и эпигенетическими вариациями.
Используемые методы
- Протокол экстракции гистонов с эффективностью 95%.
- LC-TIMS-ToF MS/MS для анализа с высоким разрешением.
- Пассивная технология для повышения чувствительности в экспериментах.
- Скрининг PTM, присутствующих в гистонах.
Основные результаты
- Успешное разделение изомерных пептидов с помощью TIMS.
- Улучшенная идентификация сайтов ПМТ.
- Расширенные возможности анализа эпигенетических вариаций.
- Потенциальные корреляции между биологическими факторами и эпигеномом.
Выводы
- Предложенный метод значительно улучшает анализ модификаций гистонов.
- Внедрение TIMS упрощает идентификацию изомеров.
- Данный подход открывает возможности для дальнейших исследований эпигенетических влияний.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Высокопроизводительный скрининг посттрансляционных модификаций (ПТМ) гистонов с использованием LC-TIMS-ToF MS/MS отвечает критической потребности в точном эпигенетическом картировании на этапах раннего поиска и валидации мишеней. Способность достоверно определять положения ПТМ и различать изомерные формы повышает прогностическую уверенность при установлении связи между эпигенетическими состояниями и биологическими ответами. Данный рабочий процесс способствует принятию взвешенных с учетом рисков решений по портфелю проектов, обеспечивая надежный количественный анализ модификаций хроматина, имеющих значение для механизмов заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать эпигенетические регуляторные механизмы посредством высокоточного картирования ПМТ.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем различения позиционных изомеров модификаций гистонов.
- Способствует снижению биологических рисков за счет корреляции паттернов ПМТ с факторами окружающей среды или генетическими факторами.
- Повышает прогностическую достоверность при продвижении эпигенетических мишеней в цикле разработки препаратов.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных биологических образцов для последующего скрининга соединений, модифицирующих хроматин.
- Получение воспроизводимых количественных профилей PTM для стандартизации и бенчмаркинга анализа.
- Обеспечение масштабируемого высокопроизводительного анализа, подходящего для проведения скрининговых кампаний.
- Поддержка надежной оценки влияния соединений на ландшафты модификаций гистонов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Позволяет сопоставить обнаружение ПТМ с эпигенетическими биомаркерами соответствующих заболеваний при наличии данных о контексте образца.
- Обеспечивает преемственность между этапом поиска эпигенетических карт и валидацией на доклинических моделях.
- Обеспечивает возможность продвижения проекта с учетом рисков путем количественной оценки изменений ПТМ в ответ на биологические воздействия.
- Способствует снижению механистических рисков в трансляционных исследованиях за счет детального профилирования модификаций.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный протокол LC-TIMS-ToF MS/MS охватывает все этапы: от первичного поиска до идентификации ведущих соединений, поддерживая рабочие процессы в исследованиях по эпигенетике, основанные как на проверке гипотез, так и на скрининге.
- Биологические исследования: способствует проверке гипотез и уточнению путей передачи сигнала путем сопоставления паттернов PTM с биологическими результатами.
- Скрининг: предоставляет готовые для анализа количественные данные PTM для оценки соединений и проверки воспроизводимости.
- Аналитика: обеспечивает высокоразрешающие измерения позиций PTM, разделение изомеров и получение спектров фрагментации для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: позволяет сопоставлять профили PTM с моделями заболеваний и стратегиями поиска биомаркеров, где это применимо.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую аналитическую платформу для текущих эпигенетических исследований в рамках нескольких программ.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации эпигенетических мишеней.
- Операционная ценность: Стандартизирует анализ ПТМ с высокой воспроизводимостью и пропускной способностью.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает принятие обоснованных решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go) и экономически эффективное управление портфелем.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию эпигенетических мишеней и программ с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области масс-спектрометрии, хроматографии и анализа протеомных данных.
- Необходим доступ к современному оборудованию LC-TIMS-ToF MS/MS и соответствующему программному обеспечению.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов подготовки образцов и интерпретации данных.
- Может потребоваться адаптация метода для различных биологических матриц или источников гистонов.
- Калибровка прибора и оптимизация метода имеют решающее значение для воспроизводимости и чувствительности.
