Изготовление монослойных сеток с графеновым покрытием для криоэлектронной микроскопии
8 сентября 2023 г.
В этой статье мы опишем протокол нанесения одного монослоя графена на сетки электронной микроскопии и способы их подготовки к использованию в криоЭМ-определении.
В настоящее время оптимальная сохранность биологических образцов является основной проблемой при получении криоЭМ-структур с высоким разрешением. В процессе пробоподготовки образцы подвергаются воздействию гидрофобной границы воздух-вода, которая оказывает денатурирующее воздействие на образцы и может привести к тому, что стабильные образцы примут преимущественную ориентацию во льду, что препятствует определению структуры с высоким разрешением. Покрытие CryoEM сеток тонким слоем углерода, такого как мягкий оксид графена, обычно используется для решения проблем, связанных с взаимодействием с границей раздела воздух-вода.
Однако эти слои часто увеличивают фоновый шум на наших изображениях, что ставит под угрозу разрешение нашей структуры. Покрытие сетки монослоем графена обеспечивает аналогичную защиту без значительного фонового шума. Использование решеток CryoEM с графеновым покрытием может помочь преодолеть проблемы, связанные с взаимодействием с границей раздела воздух-вода, однако коммерческие графеновые сетки стоят дорого, и многие лаборатории считают, что графеновые сетки слишком сложны для самостоятельного приготовления.
Исследователи в области криоЭМ теперь могут использовать этот пошаговый протокол для воспроизведения полностью произведенных десятков высококачественных графенов за один день.
Обзор
В данном исследовании рассматривается проблема оптимальной консервации биологических образцов для криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) высокого разрешения. Авторы представляют протокол нанесения на сетки для ЭМ одного монослоя графена для минимизации фонового шума и повышения целостности образца в процессе визуализации.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Криоэлектронная микроскопия
- Консервация образцов в биологической визуализации
- Применение графена в микроскопии
Теоретические основы
- Сохранение биологических образцов имеет решающее значение для получения крио-ЭМ структур с высоким разрешением.
- Традиционные углеродные покрытия могут увеличивать фоновый шум при визуализации.
- Графен обеспечивает защитный слой, не ухудшая качество изображения.
Используемые методы
- Нанесение монослоя графена на сетки для электронной микроскопии
- Методы криоэлектронной микроскопии
- Использование самодельных центрифуг для нанесения покрытий и различных очищающих средств
Основные результаты
- Сетки с графеновым покрытием характеризуются сниженным уровнем фонового шума при визуализации.
- Данный метод позволяет осуществлять массовое производство высококачественного графена за один день.
- Сетки для ЭМ демонстрируют эффективное сохранение и концентрирование биологических образцов.
Выводы
- Данный протокол представляет собой простой способ изготовления сеток для ЭМ с графеновым покрытием в лабораторных условиях.
- Это достижение расширяет возможности получения более качественных изображений при криоэлектронной микроскопии в биологических исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Криоэлектронная микроскопия (криоЭМ) высокого разрешения играет ключевую роль в структурной биологии и разработке лекарственных средств, однако денатурация образцов и ориентационное смещение на границе раздела фаз «воздух-вода» ограничивают качество данных и пропускную способность. Сетки с покрытием из однослойного графена позволяют устранить эти недостатки, сохраняя целостность макромолекул и снижая уровень фонового шума, что оказывает прямое влияние на ранние этапы поиска соединений и валидацию мишеней. Масштабируемое внутреннее производство графеновых сеток способствует их более широкому внедрению, обеспечивая возможность проведения структурных исследований по всему портфелю проектов и ускоряя снижение рисков за счет выяснения механизмов действия.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Обеспечивает высокоточное структурное исследование макромолекулярных комплексов для валидации мишеней.
- Снижает денатурацию и агрегацию, способствуя снижению технических рисков при изучении механизмов на ранних этапах поиска.
- Увеличивает разнообразие ориентаций, повышая достоверность прогнозов в структурных моделях.
Скрининг и разработка анализа
- Облегчает подготовку воспроизводимых крио-ЭМ сеток с низким уровнем фона для последующего скрининга.
- Поддерживает количественную визуализацию за счет минимизации шума и артефактов концентрации.
- Позволяет проводить надежную оценку белковых комплексов при более низких концентрациях образца.
Трансляционные и доклинические исследования
- Улучшает преемственность от этапа поиска до доклинической валидации за счет обеспечения надежного генерирования структурных данных.
- Соответствует принципам разработки трансляционных биомаркеров благодаря повышенному структурному разрешению.
- Снижает риск неудач на поздних стадиях из-за неоднозначных или недостоверных структурных данных.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Сетки, покрытые однослойным графеном, интегрируются в рабочий процесс криоэлектронной микроскопии (cryoEM) на всех этапах — от начального поиска до идентификации перспективных соединений и доклинических исследований, обеспечивая поддержку структурных исследований на основе гипотез и позволяя получать воспроизводимые высококачественные изображения.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез и уточнению путей передачи сигналов за счет сохранения нативных конформаций макромолекул.
- Скрининг: обеспечивает создание стандартизированных воспроизводимых сеток для количественного криоэлектронного анализа.
- Аналитика: позволяет получать изображения с низким уровнем шума и высоким разрешением для проведения надежного сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: повышает преемственность доклинических исследований, обеспечивая надежную структурную характеристику терапевтических кандидатов.
- Корпоративное повторное использование: создает масштабируемую и экономически эффективную платформу для проведения повторяющихся структурных исследований в рамках различных программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в структурной биологии.
- Операционная ценность: Стандартизирует подготовку сеток, улучшает воспроизводимость и обеспечивает возможность масштабирования серийного производства.
- Стратегическая ценность: Ускоряет принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и снижает биологические риски на поздних стадиях за счет получения более качественных данных.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение структурно подтвержденных мишеней.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с сетками для криоэлектронной микроскопии (cryoEM) и манипуляций с графеном.
- Необходим доступ к спин-коатерам, вытяжным шкафам и стандартной инфраструктуре для подготовки сеток для ЭМ.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимого качества сеток и результатов визуализации.
- Может потребоваться адаптация для различных классов белков или типов образцов.
- Потенциальные ограничения включают чувствительность при работе с материалами и необходимость начального обучения этапам переноса графена.
