Одноклеточная сортировка иммунофенотипированных мезенхимальных стволовых клеток отслоившихся молочных зубов человека
10 ноября 2023 г.
Данный протокол описывает использование флуоресцентно-активированной сортировки мезенхимальных стволовых клеток человека методом одноклеточной сортировки. В частности, использование сортировки отдельных клеток позволяет достичь 99% чистоты иммунофенотипированных клеток из гетерогенной популяции в сочетании с многопараметрическим подходом, основанным на проточной цитометрии.
В этом протоколе подробно описан важнейший метод точной характеристики и очистки мезенхимальных стволовых клеток человека на единой платформе, обеспечивающий эффективное последующее применение, такое как трансплантация стволовых клеток. Это особенно важно для клинических лабораторий, улучшающих молекулярные и цитогенетические анализы за счет точной сортировки инженерных или природных стволовых клеток. К наиболее часто используемым методам выделения очищенных популяций стволовых клеток относятся такие методы, как иммуномагнитная сепарация, градиент плотности или микрофлюидная сортировка клеток.
Такой метод, как индексная сортировка, позволяет связать его с профилированием РНК одной клетки, которое может извлекать транскриптомную информацию о каждой отсортированной клетке. Основные задачи связаны с поддержанием качества образцов, оптимизацией условий культивирования клеток, включая плотность и жизнеспособность клеток во время и после сортировки. Кроме того, следует рассмотреть возможность выбора подходящих размеров сопел для прибора и обеспечения своевременного доступа к сортировщикам.
Этот протокол иллюстрирует точную панель окрашивания для иммунофенотипирования и сортировки желаемой клеточной популяции. Он обеспечивает стандартизированное качество образцов, оптимальную жизнеспособность клеток, плотность для сортировки клеточных популяций и определяет экспериментальные параметры сортировки в программном обеспечении FACSDiva. Этот метод позволяет проводить прямой отбор и иммунофенотипирование популяции стволовых клеток, экспрессирующих специфические биомаркеры.
Эта простая платформа обеспечивает эффективную сортировку на основе целевой популяции, помогая и получая очищенные образцы для последующего применения.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описан метод точного выделения и характеризации мезенхимальных стволовых клеток (МСК) человека с помощью сортинга клеток с флуоресцентной активацией (FACS). Данный протокол позволяет повысить чистоту популяций стволовых клеток до 99%, что облегчает их использование в дальнейшем, например, для трансплантации стволовых клеток.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Биология стволовых клеток
- Методы сортировки клеток
- Методы иммунофенотипирования
Теоретическая часть
- Значимость МСК в клиническом применении
- Трудности получения чистых популяций стволовых клеток
- Существующие методы изоляции стволовых клеток
Используемые методы
- Сортировка клеток с помощью флуоресценции (FACS)
- Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) человека
- Мультипараметрическая проточная цитометрия
Основные результаты
- Достигнута чистота иммунофенотипированных клеток 99% при помощи FACS
- Продемонстрирована успешная дифференцировка в различные линии (адипоциты, остеобласты, хондроциты)
- Предложены стратегии оптимизации культивирования и сортировки клеток
Выводы
- Данный метод значительно повышает точность изоляции стволовых клеток.
- Он имеет важное значение для развития исследований стволовых клеток и их терапевтического применения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Сортировка единичных иммунофенотипированных мезенхимальных стволовых клеток (МСК), выделенных из эксфолиированных молочных зубов человека, позволяет решить критическую проблему клеточной гетерогенности в регенеративных исследованиях. Обеспечивая точную изоляцию гомогенных субпопуляций МСК, данный рабочий процесс повышает прогностическую достоверность последующей дифференцировки и функциональных анализов. Этот подход способствует надежной валидации мишеней и снижает риски при принятии решений по портфелю регенеративных методов и клеточной терапии на ранних стадиях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет проводить тщательный анализ идентичности субпопуляций МСК с помощью многопараметрического иммунофенотипирования.
- Способствует снижению биологических рисков путем выделения функционально различных подмножеств клеток для изучения механизмов их действия.
- Повышает точность прогнозирования определения клеточной линии и дифференцировочного потенциала кандидатных клеток.
Скрининг и разработка анализа
- Облегчает подготовку валидированных гомогенных популяций МСК для обеспечения воспроизводимости последующих анализов.
- Стандартизирует параметры сортировки клеток и иммунофенотипирования для обеспечения согласованности результатов анализа.
- Позволяет надежно оценивать дифференцировочный потенциал и функциональные показатели в рабочих процессах скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет отсортированные субпопуляции МСК с релевантными моделями дифференцировки при соответствующих заболеваниях для трансляционных исследований.
- Обеспечивает преемственность от этапа характеристики клеток при поиске до доклинической валидации регенеративных кандидатов.
- Снижает риск функциональной неопределенности при разработке клеточной терапии.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол сортинга единичных клеток интегрируется в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, обеспечивая получение высокочистых иммунофенотипированных MSC для функциональных анализов и анализов на дифференцировку.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез о гетерогенности МСК и их линейном потенциале с помощью многопараметрической проточной цитометрии.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые количественные данные об экспрессии маркеров клеточной поверхности и готовности к дифференцировке.
- Аналитика: позволяет проводить статистическое сравнение субпопуляций, определенных по маркерам, и последующие функциональные анализы.
- Трансляционные исследования: связывают результаты сортировки клеток с доклиническими моделями регенерации тканей и значимостью для патологий.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает стандартизированный, адаптируемый рабочий процесс для сортировки единичных клеток из различных источников стволовых клеток.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозирования идентичности и функции МСК, снижая механистическую неопределенность.
- Операционная ценность: повышает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость сортировки клеток и последующих анализов.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки кандидатов для клеточной терапии и оптимизирует распределение ресурсов.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию программ регенеративной и клеточной терапии с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуются навыки в области проточной цитометрии, иммунофенотипирования и оптимизации культивирования клеток.
- Необходим доступ к многопараметрическим проточным цитометрам и совместимому аналитическому программному обеспечению.
- Требуется межкомандная стандартизация панелей окрашивания и стратегий гейтирования.
- Метод может быть адаптирован для других источников стволовых клеток при условии соответствующего подбора и валидации маркеров.
- Результат зависит от сохранения жизнеспособности клеток и качества образцов в процессе сортировки и последующей обработки.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:06
A Step‐by‐Step Guide for Seeding and Differentiation of Mesenchymal Stem Cell Cultures for Characterization
4:10
Lineage‐Specific Cytochemical Staining of Mesenchymal Stem Cells for Characterizing Differentiated Cells
6:07
Mesenchymal Stem Cell Surface Staining for Immunophenotyping
8:30
Mesenchymal Stem Cell Sample Preparation,Flow Cytometric Analysis, and Cell Sorting
