Ex vivo Кальциевая визуализация для модели эпилепсии дрозофилы
13 октября 2023 г.
Здесь мы представляем протокол визуализации ex vivo кальция у взрослых дрозофил, экспрессирующих GCaMP6, для мониторинга эпилептиформной активности. Протокол предоставляет ценный инструмент для исследования иктальных событий у взрослых дрозофил с помощью визуализации кальция ex vivo , что позволяет исследовать потенциальные механизмы эпилепсии на клеточном уровне.
В последнее время многие гены-кандидаты на эпилепсию были обнаружены в генетических тестах, а затем в экспериментах на животных. Мы предлагаем набор методов для изучения нейронной активности, связанной с эпилепсией, включая запись целых клеток, вызванную запись EPSP и новую, которую мы представим здесь, визуализацию кальция ex vivo. Поскольку целостность мозга и его нейронных сетей не может быть полностью воспроизведена в клеточной культуре или срезах мозга, основным преимуществом текущего эксперимента является получение неповрежденной ткани мозга при одновременной защите нейронных сетей от повреждений.
Мы разработали метод визуализации кальция ex vivo вместе с анализом судорожного поведения для эффективного скрининга генов, связанных с эпилепсией, и изучения основных механизмов эпилепсии на клеточном уровне. Мы внедрили изолированные, неповрежденные ткани мозга дрозофилы для визуализации кальция, что позволяет избежать сложных хирургических техник и сохранить целостность нейронных сетей. Кроме того, метод ex vivo может обеспечить превосходное соотношение сигнал/шум по сравнению с методами визуализации in vivo.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен протокол экс-виво кальциевого имиджинга у взрослых особей Drosophila, экспрессирующих GCaMP6, для изучения эпилептиформной активности. Метод направлен на мониторинг иктальных событий у Drosophila, что позволяет получить представление о клеточных механизмах, лежащих в основе эпилепсии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Исследование эпилепсии
- Кальциевый имиджинг
Теоретическая база
- Гены-кандидаты, связанные с эпилепсией, требуют валидации на моделях животных.
- Методы ex vivo позволяют сохранить целостность нейронных сетей, что крайне важно для изучения эпилепсии.
- Кальциевый имиджинг обеспечивает более высокое качество сигнала по сравнению с подходами in vivo.
- Drosophila является подходящим модельным организмом для исследования нейронной активности.
Цель исследования
- Разработать методы кальциевого имиджинга ex vivo у Drosophila.
- Провести скрининг генов, связанных с эпилепсией, и изучить лежащие в их основе нейронные механизмы.
- Количественно оценить поведение, напоминающее эпилептические приступы.
Используемые методы
- Основной платформой исследования является экс-виво визуализация кальция в интактных тканях мозга Drosophila.
- Биологическая модель представлена взрослыми особями Drosophila, экспрессирующими GCaMP6.
- Приведены подробные протоколы выделения мозга, настройки системы визуализации и анализа данных.
- Для оценки судорожной активности применялись поведенческие тесты.
- Количественные показатели, такие как интенсивность флуоресценции, анализировались с помощью ImageJ.
Основные результаты
- Наблюдались кальциевые сигналы в нейронах грибовидных тел с особым вниманием к различиям между мухами с нокдауном и мухами дикого типа.
- Мухи с нокдауном Cac демонстрировали значительно более выраженную судорожную активность и измененное время восстановления.
- Данные флуоресценции указывают на увеличение количества крупных спайков в группе с нокдауном, что дает представление о механизмах развития эпилепсии.
Выводы
- Данный протокол позволяет исследователям изучать механизмы судорог у Drosophila, что способствует валидации генов в исследованиях эпилепсии.
- Понимание паттернов кальциевой сигнализации дает представление о возбудимости нейронов и потенциальных терапевтических мишенях.
- Полученные результаты расширяют знания о механизмах эпилепсии благодаря применению надежного метода визуализации.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Кальциевый имиджинг ex vivo у Drosophila, экспрессирующих GCaMP6, позволяет проводить прямое функциональное исследование генов, связанных с эпилепсией, в интактных нейронных сетях. Данный подход повышает точность прогнозирования при валидации мишеней за счет корреляции генетических пертурбаций с количественно определяемой нейронной активностью и судорожным поведением. Метод способствует принятию решений по портфелю проектов на ранних стадиях, предоставляя понимание механизмов работы путей, имеющих значение для заболевания.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишеней
- Обеспечивает функциональную валидацию генов-кандидатов эпилепсии в генетически доступной модели.
- Способствует снижению механистических рисков путем установления связи между нокдауном гена и изменениями нейронной активности.
- Облегчает уточнение сигнальных путей с помощью количественной визуализации целостных нейронных цепей.
- Обеспечивает прогностическую уверенность при продвижении генетических мишеней при неврологических расстройствах.
Скрининг и разработка анализа
- Создает воспроизводимую платформу для скрининга влияния патогенных генов на нейронную активность.
- Предоставляет количественные показатели, такие как частота спайков и интенсивность флуоресценции, для стандартизации анализа.
- Подготавливает валидированные биологические системы для последующих этапов скрининга соединений или генетического скрининга.
- Обеспечивает надежное сравнение фенотипов дикого типа и мутантов в контролируемой среде ex vivo.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет паттерны нейронной активности, имеющие значение для заболевания, с поведенческими фенотипами для обеспечения трансляционной преемственности.
- Поддерживает обоснованное с учетом рисков продвижение исследования путем корреляции клеточных механизмов с наблюдаемыми формами судорожного поведения.
- Обеспечивает переход от генетических открытий к валидации доклинических моделей в исследованиях эпилепсии.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол визуализации ex vivo интегрируется в континуум исследований — от валидации мишени до доклинического изучения механизмов, обеспечивая как проверку гипотез, так и количественное фенотипирование.
- Открывающая биология: обеспечивает возможность проверки гипотез о функциях генов в нейронных цепях, имеющих значение при эпилепсии.
- Скрининг: предоставляет стандартизированные количественные показатели для сравнения генетических или фармакологических воздействий.
- Аналитика: обеспечивает получение измеримых данных, таких как классификация спайков и интенсивность флуоресценции, для проведения надежного статистического анализа.
- Трансляционные исследования: связывают изменения клеточной активности с поведенческими фенотипами приступов, что способствует определению соответствующих биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: предлагает масштабируемую, многократно используемую платформу для функциональной геномики и скрининга нейронной активности по различным генным мишеням.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования и снижает неопределенность механизмов при валидации мишеней.
- Операционная ценность: Стандартизирует анализы нейронной активности для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости на ранних этапах поиска.
- Стратегическая ценность: Обосновывает решения о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go), связывая генетические пертурбации с количественно оцениваемыми результатами нейронной активности.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию генных мишеней при эпилепсии с учетом рисков для их дальнейшей разработки.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области генетики Drosophila и методов конфокальной визуализации.
- Необходим доступ к конфокальной микроскопии и инструментам количественного анализа изображений.
- Требуется межкомандная стандартизация классификации спайков и поведенческих тестов.
- Адаптация к другим модельным системам может потребовать оптимизации протокола для сохранения целостности тканей и настройки параметров визуализации.
- Интерпретация ограничена нейронными цепями и поведением, смоделированными на Drosophila в соответствии с данным протоколом.
