Упрощенные внутрибедренные инъекции с использованием живых мышей позволяют проводить непрерывный анализ костного мозга
10 ноября 2023 г.
Этот протокол описывает внутрибедренное введение нескольких гемопоэтических или лейкозных стволовых клеток, включая генетически отредактированные клетки, в мышиные модели ксенотрансплантата, что позволит не только быстро и безопасно пересадить клетки, но и провести серийный анализ костного мозга.
Этот метод призван помочь нам лучше понять биологию нормального кроветворения и заболевания в костном мозге путем безопасного введения и трансплантации ценных образцов пациента мышам внутриорально с последующей аспирацией костного мозга. Давно известно, что более эффективно пересаживать небольшое количество ценных образцов непосредственно в костный мозг мышей для экспериментов, проводимых путем внутривенного введения. Тем не менее, нет никаких реальных технических видео, поэтому обычно считалось, что это техника с высоким барьером.
Наш протокол позволяет легко и безопасно приживить мышь любой ценный образец с помощью небольшого количества клеток. Существует высокий спрос на эту технологию, и с помощью этого видео любой желающий сможет быстро ее освоить. Мы надеемся, что каждый сможет освоить эту технологию и внести существенный вклад в развитие науки.
Для начала приготовьте клеточные суспензии с использованием до 3 миллионов образцов клеток с использованием 20 микролитров буфера FACS или размораживаемой среды. Держите их на льду перед инъекцией. Продезинфицируйте ногу, содержащую бедренную кость, с помощью трех наборов чередующихся скрабов с использованием скраба с повидон-йодом или хлоргексидином и марлевых губок, пропитанных на 70% этанолом.
Стабилизируйте ногу, зажав бедренную кость большим и указательным пальцами. Надавите на большеберцовую кость безымянным или пятым пальцем, чтобы большеберцовая кость была согнута от бедренной кости. Обеспечьте правильное положение для успешной инъекции.
Используйте край пустой стерильной иглы 27G, чтобы проклевать сухожилие надколенника на верхней части бедренной кости. Чтобы обеспечить наилучшую точку введения, введите иглу 27G с прикрепленным шприцем прямо под сухожилие надколенника. Надежно засунув его между двумя мыщелками бедренной кости, поверните иглу наружу и вверх, чтобы выровнять ее параллельно стержню бедренной кости.
Вращайте иглу по кругу, продвигая ее в полость бедренного мозга. Вводите иглу до тех пор, пока не произойдет заметное снижение сопротивления. Подтвердите правильное положение иглы боковым движением.
Создайте отрицательное давление, оттягивая поршень иглы назад, перемещая иглу в полость костного мозга. Проверьте наличие крови или костного мозга в шприце, чтобы убедиться, что игла находится в полости костного мозга. Убедившись в правильном размещении иглы, медленно извлеките ее и вставьте ячейку со шприцем через тот же корень.
Важно помнить о корне и угле первого укола при переходе на новую иглу. После того, как клетки будут успешно введены в бедренную кость, осторожно извлеките иглу и шприц, поддерживая давление на шприц. Затем снимите мышь с носового конуса и положите ее на чистое бумажное полотенце, чтобы предотвратить аспирацию подстилки.
Для восстановления держите мышь на грелке или другой контролируемой поверхности. Обеспечьте восстановление после анестезии, прежде чем положить их обратно на стойку для мышей. Наблюдайте за мышами на предмет признаков дистресса или инфекции в течение следующих 24 часов.
Начните с подготовки к процедуре перед аспирацией костного мозга, смочите 0,5 миллилитровый шприц 27G с CSM, заполнив и вытеснив CSM два-три раза. Затем осторожно отсасывайте костный мозг от мыши, находящейся под наркозом, с получением от 20 до 50 микролитров костного мозга. Затем полностью извлеките иглу из бедренной кости и суспензируйте аспирированный образец в 500 микролитрах CSM.
Снимите мышь с носового конуса и положите ее на чистое бумажное полотенце, чтобы предотвратить аспирацию подстилки во время восстановления. Наблюдайте за всеми мышами, чтобы убедиться в восстановлении после анестезии, прежде чем помещать их на заднюю часть стойки для мышей. Пеллеты клеток из костного мозга с пятиминутным вращением при 300G при четырех градусах Цельсия.
Отсадите надосадочную жидкость и добавьте буфер для лизиса ACK в каждую пробирку. Сделайте ячейки вихревыми для их суспензии и поместите их на лед на 5-10 минут. Отфильтруйте клеточную суспензию через капроновую сетку в новую пробирку.
Промойте исходный тюбик буфером FACS и пропустите его через нейлоновую сетку, снова грануляционные ячейки, вращая в течение пяти минут при 300G при четырех градусах Цельсия. Отсадите надосадочную жидкость из гранулированных клеток и добавьте окрашивающий раствор, содержащий нужные антитела. Держите трубочки на льду в течение 20 минут.
Промойте клетки и приступайте к их анализу в соответствии с экспериментальной установкой. Методы трансплантации могут быть легко оценены с минимальной инвазией мышей с помощью биолюминесцентного изображения. В данном случае трансплантация клеточной линии K562 человеческого происхождения с помощью Acalook наблюдалась в мышиной модели ксенотрансплантата на стороне инъецированной бедренной кости.
Трансплантация CD34-положительных HSPC привела к приживлению более 10-20% клеток человека через восемь недель после трансплантации. Аналогичным образом, трансплантация ГСК, полученных из пуповинной крови, привела к приживлению до 10% человека через восемь недель после трансплантации. С помощью этой процедуры была достигнута дальнейшая успешная трансплантация ГСКХ, полученных из костного мозга взрослого человека, стволовых клеток лейкемии, CRISPR Cas9, полученных из пуповинной крови, и ОМЛ, полученных от пациента.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается методика внутрибедренной инъекции гемопоэтических или лейкозных стволовых клеток в моделях мышей. Этот метод обеспечивает безопасную трансплантацию и позволяет проводить серийный анализ костного мозга.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Гемопоэз
- Биология стволовых клеток
- Модели ксенотрансплантатов
Теоретические сведения
- Понимание нормального кроветворения и связанных с ним заболеваний имеет решающее значение для развития медицинской науки.
- Прямое введение в костный мозг более эффективно, чем внутривенные методы.
- В предыдущих методиках отсутствовали доступные учебные ресурсы.
- Данный протокол направлен на упрощение этого процесса для исследователей.
Цель исследования
- Для обеспечения безопасного и эффективного приживления ценных образцов пациентов у мышей.
- Для предоставления исследователям четкого руководства по выполнению процедуры.
- Для углубления понимания гематологических заболеваний.
Используемые методы
- Приготовление клеточных суспензий с использованием FACS-буфера.
- Дезинфекция и стабилизация места инъекции.
- Методика интрафеморального введения с использованием стерильной иглы.
- Аспирация костного мозга для анализа после инъекции.
Основные результаты
- Успешное приживление стволовых клеток человеческого происхождения в мышиных моделях.
- Продемонстрированы высокие показатели приживления человеческих клеток через восемь недель.
- Успешная трансплантация различных типов стволовых клеток, включая клетки с отредактированным геномом.
- Протокол обеспечивает минимальную инвазивность для мышей и эффективный мониторинг.
Выводы
- Данный метод представляет собой надежный способ трансплантации стволовых клеток для исследовательских целей.
- Он отвечает потребности в доступных протоколах для исследований в области гемопоэза.
- Будущие исследования могут опираться на этот метод для изучения различных гематологических заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Прямая интрафеморальная инъекция и серийная аспирация костного мозга у живых мышей позволяют проводить непрерывный малоинвазивный анализ приживления и функции гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPC). Данный подход устраняет критическое препятствие в доклинической гематологии, обеспечивая проспективную количественную оценку популяций резидентных клеток костного мозга с использованием ограниченного количества ценных образцов. Метод повышает прогностическую достоверность трансляционных исследований и способствует принятию обоснованных решений по управлению рисками в портфеле разработок на ранних стадиях клеточной терапии и исследований гематологических заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую исследовать приживление HSPC и выход клеточных линий в физиологически релевантной нише костного мозга.
- Обеспечивает механистическое снижение рисков за счет возможности серийного извлечения и фенотипирования трансплантированных клеток с течением времени.
- Способствует функциональной валидации популяций клеток, подвергшихся редактированию генома или полученных от пациента, in vivo.
Скрининг и разработка методов анализа
- Обеспечивает валидированную систему in vivo для оценки эффективности приживления и судьбы клеток при использовании малого количества образцов.
- Позволяет проводить воспроизводимое количественное измерение химеризма костного мозга и клеточного состава после трансплантации.
- Способствует стандартизации анализа для рабочих процессов ксенотрансплантации и трансплантации стволовых клеток.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделированию гематологических заболеваний и терапевтических вмешательств, имеющим клиническое значение.
- Обеспечивает возможность лонгитюдного отслеживания приживления и персистенции человеческих клеток в мышиных ксенотрансплантационных моделях.
- Способствует разработке трансляционных биомаркеров путем корреляции показателей костного мозга с функциональными результатами.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод связывает этапы раннего поиска, идентификации ведущих соединений и доклинической валидации, обеспечивая непрерывный количественный анализ приживления костного мозга в моделях живых животных.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез о функциях HSPC и взаимодействиях с нишей за счет прямого доступа к костному мозгу.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые количественные данные о приживаемости для исследуемых популяций клеток.
- Аналитика: позволяет проводить серийные измерения химеризма костного мозга и фенотипа клеток для сравнительных исследований.
- Трансляционные исследования: способствуют переходу от результатов in vitro к валидации in vivo на моделях соответствующих заболеваний.
- Корпоративное использование: создает масштабируемую, многократно используемую платформу для различных программ исследований в области клеточной терапии и гематологии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов приживления и функционирования HSPC за счет возможности прямого серийного анализа костного мозга.
- Операционная ценность: стандартизирует малоинвазивные процедуры для высокозначимых исследований по трансплантации с низким количеством клеток.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработок («go/no-go»), предоставляя надежные количественные данные in vivo на ранних этапах.
- Влияние на портфель: обеспечивает приоритизацию активов в области клеточной терапии и гематологии с учетом рисков на основе функциональных результатов in vivo.
Особенности реализации
- Требуется технический опыт работы с мышами, проведения анестезии и техники внутрибедренных инъекций.
- Необходим доступ к FACS-анализу и инфраструктуре визуализации для последующей характеризации клеток.
- Для обеспечения воспроизводимости требуется строгая стандартизация протоколов инъекций и аспирации между членами команды.
- Метод адаптируем к различным источникам клеток, включая генно-модифицированные HSPCs, HSPCs, полученные от пациентов, и HSPCs из пуповинной крови.
- Ограничением является необходимость тщательного послепроцедурного мониторинга для обеспечения благополучия животных и целостности данных.
