Выделение кишечника из личинок данио-рерио для секвенирования одноклеточной РНК
10 ноября 2023 г.
Здесь мы опишем метод выделения кишечника из личинок данио-рерио через 5 дней после оплодотворения для анализа секвенирования РНК одной клетки.
Наше исследование направлено на изучение транскриптомных изменений, происходящих в процессе развития и дисфункции желудочно-кишечного тракта у личинок данио-рерио. Здесь мы предлагаем новый протокол, который позволяет выделять различные типы клеток в кишечнике рыбок данио, что имеет потенциальное применение в понимании здоровья и заболеваний желудочно-кишечного тракта. В последние годы растет интерес к изучению взаимодействия между энтеральной нервной системой и другими типами кишечных клеток во время развития и заболевания.
Понимание этой сложной динамики с использованием передовых методов, таких как секвенирование одноклеточной РНК, может дать важную информацию о кишечных нейромиопатиях, что приведет к более точной диагностике и лечению. Используя этот протокол, мы успешно идентифицировали различные типы кишечных клеток, включая эпителиальные, стромальные, кровяные, мышечные, иммунные клетки и даже энтеральные нейроны и глию, которые ранее не были захвачены в таком количестве с использованием аналогичных подходов. Таким образом, мы предоставляем надежную методику исследования состава желудочно-кишечного тракта в период развития и дисфункции.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен новый протокол выделения клеток кишечника из личинок zebrafish на 5-е сутки после оплодотворения, что позволяет проводить анализ секвенирования РНК отдельных клеток. Данный метод направлен на углубление понимания процессов развития и дисфункции желудочно-кишечного тракта.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология развития
- Здоровье желудочно-кишечного тракта
Теоретические сведения
- Исследование изменений транскриптома в процессе развития желудочно-кишечного тракта.
- Изучение взаимодействий между передней нервной системой и типами клеток кишечника.
- Значимость передовых методов в изучении нейромиопатий.
- Потенциал для совершенствования диагностики и методов лечения.
Цель исследования
- Обеспечение надежного метода выделения различных типов кишечных клеток.
- Углубление понимания состава желудочно-кишечного тракта в процессе развития.
- Изучение влияния данных процессов на здоровье и заболевания желудочно-кишечного тракта.
Используемые методы
- Выделение различных типов клеток кишечника zebrafish.
- Применение секвенирования РНК единичных клеток.
- Идентификация эпителиальных, стромальных, кровеносных, мышечных и иммунных клеток, а также энтерических нервных ганглиев.
- Использование нового протокола для повышения эффективности захвата клеток.
Основные результаты
- Успешная идентификация различных типов клеток кишечника.
- Новые представления о динамике здоровья и заболеваний желудочно-кишечного тракта.
- Углубленное понимание передних нейромиопатий.
- Надежный метод изучения состава желудочно-кишечного тракта.
Выводы
- Данный протокол представляет собой значительный шаг вперед в области изоляции клеток кишечника.
- Он открывает новые возможности для дальнейших исследований здоровья желудочно-кишечного тракта.
- Метод обладает потенциалом для углубления понимания процессов развития и патогенеза заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Секвенирование РНК отдельных клеток кишечника личинок zebrafish позволяет проводить высокоточное картирование разнообразия кишечных клеток в процессе развития и при моделировании заболеваний. Данный протокол способствует валидации мишеней на ранних этапах и снижению механистических рисков для портфелей исследований желудочно-кишечного тракта. Этот подход повышает прогностическую уверенность при выборе соответствующих систем моделирования заболеваний и поиске трансляционных биомаркеров.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать специфичные для конкретных типов клеток транскриптомы на модели позвоночных.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем изоляции энтеральных нейронов, глии и иммунных клеток.
- Способствует механистическому снижению рисков для нейромышечных и эпителиальных мишеней при заболеваниях ЖКТ.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение валидированных жизнеспособных суспензий из отдельных клеток для последующих транскриптомных анализов.
- Стандартизирует изоляцию и сортировку клеток для получения воспроизводимых количественных результатов.
- Позволяет масштабировать подготовку клеток кишечника для платформ высокопроизводительного скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит состав клеток кишечника zebrafish в соответствие с биологией ЖКТ человека, имеющей значение для патологий.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации мишеней в ЖКТ.
- Позволяет осуществлять риск-ориентированный отбор кандидатных мишеней на основе профилей экспрессии, специфичных для конкретных типов клеток.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный протокол встраивается в континуум от поиска мишени до доклинических исследований, обеспечивая возможность изоляции и профилирования типов клеток кишечника для идентификации мишеней, их валидации и изучения механизмов.
- Фундаментальная биология: позволяет проверять гипотезы о развитии и дисфункции ЖКТ с разрешением на уровне отдельных клеток.
- Скрининг: обеспечивает получение воспроизводимых жизнеспособных популяций клеток для транскриптомного и фенотипического анализа.
- Аналитика: предоставляет количественные данные об экспрессии генов для сравнительного анализа различных типов клеток и условий.
- Трансляционные исследования: связывает биологию ЖКТ Danio rerio и человека для согласования биомаркеров и моделирования заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальный рабочий процесс для изоляции клеток кишечника и анализа отдельных клеток в различных программах исследований ЖКТ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при выборе мишеней в ЖКТ и углубляет понимание механизмов.
- Операционная ценность: Стандартизирует изоляцию и сортировку клеток для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки («go/no-go») за счет получения транскриптомных данных по конкретным типам клеток.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию мишеней в ЖКТ и моделей заболеваний с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с Danio rerio, проведения диссекции и выполнения протоколов анализа единичных клеток.
- Необходим доступ к оборудованию для FACS и платформам для секвенирования РНК единичных клеток.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости изоляции и сортировки клеток.
- Может потребоваться адаптация метода для других стадий развития или модельных организмов.
- Жизнеспособность и выход клеток зависят от точности проведения диссекции и этапов ферментативной диссоциации.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:22
Obtaining Wildtype and Transgenic Zebrafish Larvae and WildType Whole Larvae Dissociation
2:50
Isolation and Dissociation of Gut from Zebrafish Larvae for FACS Enrichment of Gut Cells
5:25
FACS Enrichment of Zebrafish Gut Cell Suspension for scRNAseq
