Высокопроизводительная экспрессия и очистка носителей растворенных веществ человека для структурных и биохимических исследований
29 сентября 2023 г.
Структурные и биохимические исследования мембранных транспортеров человека требуют миллиграммовых количеств стабильного, интактного и однородного белка. В этой статье мы опишем масштабируемые методы скрининга, экспрессии и очистки переносчиков растворенных веществ человека с использованием генов, оптимизированных для кодонов.
Носители растворенных веществ, или SLC, отвечают за поглощение питательных веществ и участвуют в заболеваниях человека. Тем не менее, существует мало препаратов, нацеленных на SLC, потому что они плохо изучены. Мы разработали эффективные подходы к клонированию, экспрессии и очистке SLC.
Наш рабочий процесс позволяет получать чистые белки, что позволяет проводить биохимические и структурные исследования и, в конечном итоге, дает информацию для кампаний по разработке лекарств. Благодаря многочисленным ролям в биологических процессах, заболеваниях и доставке лекарств, SLC все чаще привлекают внимание и становятся привлекательными терапевтическими мишенями. В рамках частных, государственных проектов ReSOLUTE IMI были созданы ресурсы и данные с открытым доступом, позволяющие делать новые открытия в области функционирования SLC, физиологии, патологии и терапевтического таргетирования.
Традиционно SLC было сложно изучать, поскольку они представляют собой интегральные мембранные белки с различными субстратами и разнообразными механизмами переноса. В последнее время Крио-ЭМ, система экспрессии BacMam и новые реагенты для солюбилизации привели к существенному изменению их характеристик. Образцы чистого белка необходимы для биохимических и структурных исследований.
У человека носители растворенных веществ часто имеют плохой выход при чрезмерной экспрессии и нестабильную при очистке. Таким образом, в прошлом для каждой мишени требовались годы для разработки отдельных структур для производства образца белка для последующих применений. Наш метод оптимизирован для параллельного и экономичного исследования нескольких мишеней или конструкций одной мишени.
Таким образом, он тщательно балансирует между гибкостью эксперимента, стоимостью, временем и лабораторными ресурсами. Кроме того, мы предлагаем открытый доступ ко всем нашим протоколам и ресурсам в этой статье и на веб-портале ReSOLUTE.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Данное исследование посвящено переносчикам растворенных веществ (SLC), которые играют ключевую роль в поглощении питательных веществ и связаны с различными заболеваниями человека. Исследователи разработали эффективные методы клонирования, экспрессии и очистки SLC, что позволило проводить дальнейшие биохимические и структурные исследования.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биохимия
- Фармакология
Теоретическая база
- Белки-переносчики растворенных веществ играют жизненно важную роль в транспорте питательных веществ.
- Они участвуют в развитии ряда заболеваний человека.
- Несмотря на их значимость, лишь немногие лекарственные препараты воздействуют на SLC из-за ограниченности исследований.
- Недавние инициативы были направлены на углубление понимания функций SLC.
Цель исследования
- Разработка масштабируемых методов изучения белков-переносчиков SLC человека.
- Получение чистых белков для биохимического и структурного анализа.
- Содействие усилиям по поиску лекарственных средств, мишенями которых являются белки SLC.
Используемые методы
- Клонирование кодон-оптимизированных генов для SLC.
- Экспрессия белков SLC в подходящих системах.
- Очистка белков для получения гомогенных образцов.
- Использование открытых ресурсов проектов IMI для доступа к данным.
Основные результаты
- Были разработаны эффективные методы клонирования и экспрессии.
- Для дальнейших исследований были получены высокочистые белки SLC.
- Данное исследование дает представление о функциях SLC и их терапевтическом потенциале.
- Полученные данные служат поддержкой для текущих исследований физиологии и патологии SLC.
Выводы
- Разработанные методы значительно расширяют возможности изучения SLC.
- Полученные данные могут привести к созданию новых стратегий поиска лекарственных средств.
- Более глубокое понимание SLC может улучшить терапевтическое воздействие на мишени.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Человеческие переносчики растворенных веществ (SLC) представляют собой обширный, недостаточно изученный класс мембранных транспортеров, обладающих значительным терапевтическим потенциалом, однако их структурная и биохимическая характеристика отстает из-за сложностей с экспрессией и очисткой. Данный высокопроизводительный рабочий процесс обеспечивает параллельное масштабируемое производство чистых, функционально активных белков SLC, напрямую устраняя ключевое препятствие на этапах раннего поиска лекарственных средств и валидации мишеней. Обеспечивая доступ к высококачественным образцам SLC, этот метод способствует снижению рисков для всего портфеля разработок и ускоряет оценку этих мишеней для фармацевтического вмешательства.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет систематически изучать функцию и субстратную специфичность транспортеров SLC.
- Обеспечивает механическое снижение рисков, предоставляя структурно целостный, биохимически активный белок для проверки гипотез.
- Способствует валидации мишеней за счет воспроизводимого параллельного получения нескольких конструкций SLC.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение высокоочищенных белков SLC, подходящих для количественного биохимического анализа и исследований транспорта.
- Стандартизирует количество вводимого белка для последующего высокопроизводительного скрининга и исследований взаимодействия.
- Повышает воспроизводимость и масштабируемость анализа за счет обеспечения стабильного качества и выхода белка.
Трансляционные и доклинические исследования
- Позволяет проводить структурные исследования для изучения механизмов работы транспортеров, имеющих значение при заболеваниях, и определения возможности воздействия на них лекарственными средствами.
- Обеспечивает получение стабильных белковых препаратов для изучения связывания малых молекул и процессов транспорта в контексте разработки трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает преемственность этапов от поиска до доклинической валидации путем получения данных о стабильности и активности белков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный рабочий процесс объединяет этапы ранних открытий и идентификации ведущих соединений, обеспечивая базовые реагенты как для механистических исследований, так и для скрининговых кампаний.
- Открывающая биология: предоставляет высококачественные белки SLC для функционального и структурного анализа на основе выдвинутых гипотез.
- Скрининг: обеспечивает надежную разработку методов анализа и скрининг соединений с использованием воспроизводимого количества белков.
- Аналитика: дает количественные показатели, такие как концентрация, чистота и монодисперсность белка, для сравнения различных условий.
- Трансляционные исследования: способствуют выявлению значимых для заболеваний SLC и их фармакологической модуляции.
- Корпоративное повторное использование: создает масштабируемую, многократно используемую платформу для оценки мишеней SLC в рамках нескольких программ.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования при выборе мишеней SLC и снижает неопределенность в понимании механизмов.
- Операционная ценность: Оптимизирует производство белков с помощью стандартизированных высокопроизводительных протоколов.
- Стратегическая ценность: Ускоряет принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки («go/no-go») и улучшает распределение капитала за счет более раннего отбора мишеней.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию мишеней SLC с учетом рисков для их перевода на этапы скрининга и в доклинические разработки.
Особенности реализации
- Требуется опыт в экспрессии, очистке и аналитической характеристике мембранных белков.
- Необходим доступ к эукариотическим системам экспрессии, оборудованию для хроматографии и средствам анализа белков.
- Использование стандартизированных протоколов и ресурсов открытого доступа способствует воспроизводимости результатов между различными исследовательскими группами.
- Метод применим к различным представителям семейства SLC и вариантам конструктов, что обеспечивает широкую область применения.
- Стабильность и выход белка могут варьироваться в зависимости от целевого объекта, что требует оптимизации конструкта и буфера.
