Оптическая очистка и маркировка для световой флуоресцентной микроскопии при крупномасштабной визуализации головного мозга человека
26 января 2024 г.
Настоящий протокол обеспечивает пошаговую процедуру быстрой и одновременной оптической очистки, многократного мечения и объемной 3D-реконструкции десятков посмертных срезов мозга человека путем комбинирования (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-тиодиэтанол [TDE]) короткого метода трансформации тканей с визуализацией флуоресцентной микроскопии со световым листом в стандартном протоколе с высокой пропускной способностью.
Человеческий мозг — это сложный орган, объединяющий различные навыки. Чтобы понять его функциональность, необходимо сконструировать детальные клеточные сенсоры по всему мозгу. Наш протокол с высокой пропускной способностью позволяет анализировать 3D-цитоархитектонику объемных областей мозга человека с микрометрическим разрешением, что позволяет охарактеризовать его структуру.
Объемная реконструкция больших участков мозга человека представляет собой ряд экспериментальных задач, связанных с огромными размерами образцов мозга, сложным биологическим составом, различными условиями посмертной фиксации и хранения, а также автофлуоресцентными сигналами от пигментов липофусцинового ряда. Все это может поставить под угрозу эффективность оптической очистки и качество демонстрации. По сравнению с другими методами очистки, метод короткой трансформации тканей в сочетании с визуализацией светового листа может быть использован для быстрой и одновременной обработки нескольких участков мозга человека.
Это приводит к 3D-реконструкции мозга с субклеточным разрешением.
Обзор
В данном исследовании представлен высокопроизводительный протокол одновременного оптического просветления, многократного мечения и 3D-волюметрической реконструкции срезов посмертного мозга человека. Благодаря интеграции метода S WITCH - H 2 O 2 - Antigen R etrieval - 2,2'-тиодиэтанола (TDE) SHORT с двухфотонной флуоресцентной микроскопией с листовым освещением данная методика позволяет проводить детальную структурную характеристику с микрометровым разрешением.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Гистология
- Иммуногистохимия
Теоретические сведения
- Человеческий мозг представляет собой сложный орган, требующий детального исследования на различных масштабах.
- К основным трудностям относятся работа с крупными образцами мозга и наличие сигналов аутофлуоресценции от пигментов.
- Представленный протокол устраняет недостатки существующих методов просветления тканей.
Цель исследования
- Разработать оптимизированный протокол для анализа структуры человеческого мозга.
- Повысить эффективность оптического просветления и качество визуализации срезов тканей мозга.
- Обеспечить возможность проведения 3D-реконструкции с высокой детализацией и надежностью.
Используемые методы
- В исследовании применяется флуоресцентная микроскопия с плоскостным освещением (light-sheet microscopy).
- В качестве биологической модели используются ткани головного мозга человека; подробно описаны этапы секционирования и обработки.
- Ключевые этапы включают заливку образцов в агарозу, обработку с помощью TDE и многократное иммуноокрашивание на различные нейрональные маркеры.
- Время инкубации и температурный режим точно определены для обеспечения оптимальных условий просветления и визуализации.
Основные результаты
- Данный протокол обеспечивает эффективное оптическое просветление и высококачественную визуализацию серого и белого вещества.
- Многоэтапное окрашивание позволяет визуализировать отдельные популяции нейронов в срезах человеческого мозга.
- Метод демонстрирует возможность получения субклеточных деталей в 3D-реконструкциях.
Выводы
- В данном исследовании разработан метод комплексного анализа структуры мозга с микрометрическим разрешением.
- Предложенный подход демонстрирует потенциал для углубления наших знаний об архитектуре мозга и её значении для исследований нейронов.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для отрасли
Крупномасштабная 3D-визуализация тканей человеческого мозга с высоким разрешением имеет решающее значение для совершенствования валидации мишеней и понимания механизмов в рамках нейрофармацевтических исследований и разработок (R&D). Протокол SHORT в сочетании с плоскостной флуоресцентной микроскопией позволяет осуществлять быстрое мультиплексное структурное картирование нейронных субпопуляций как в сером, так и в белом веществе. Эта возможность повышает точность прогнозов и снижает риски на ранних этапах поиска и в точках трансляционного перехода.
Стратегические приложения в биофармацевтических исследованиях&D
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет проводить детальный анализ нейронной архитектуры и картирование субпопуляций для валидации мишеней.
- Способствует снижению механистических рисков за счет выявления цитоархитектонического контекста в тканях головного мозга человека.
- Облегчает приоритизацию портфеля препаратов, предоставляя количественные структурные данные с высоким содержанием информации.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подготавливать оптически прозрачные, многократно маркированные срезы тканей, пригодные для последующих этапов количественной визуализации.
- Стандартизирует обработку образцов для обеспечения воспроизводимости высокопроизводительной визуализации и анализа.
- Обеспечивает мультиплексное детектирование нейронных маркеров, что способствует эффективной разработке методов анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет результаты структурной визуализации с архитектурой человеческого мозга, имеющей значение для конкретного заболевания.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации, позволяя проводить прямой анализ тканей человека.
- Поддерживает принятие решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков на основе комплексных данных о 3D-цитоархитектонике.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол интегрируется в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, обеспечивая высокопроизводительную количественную визуализацию срезов головного мозга человека для валидации мишеней и изучения механизмов.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез и уточнение путей взаимодействия посредством детального картирования нейронов.
- Скрининг: позволяет получать воспроизводимые образцы, готовые к мультиплексной визуализации для количественного анализа.
- Аналитика: предоставляет многоканальные данные с субклеточным разрешением для сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: связывает фундаментальные открытия и доклинические исследования за счет прямой релевантности тканям человека.
- Корпоративное повторное использование: создает масштабируемый стандартизированный рабочий процесс для многократного применения в различных нейробиологических программах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации нейробиологических мишеней.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированную, масштабируемую и воспроизводимую обработку тканей и визуализацию.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективно управлять портфелем активов.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение нейрофармацевтических активов.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области обработки тканей, иммуномаркировки и передовых методов микроскопии.
- Необходим доступ к установке для плоскостной флуоресцентной микроскопии и инфраструктуре для многоканальной визуализации.
- Требуется межгрупповая стандартизация протоколов подготовки образцов и визуализации.
- Может потребоваться адаптация методики для различных отделов мозга или состояний тканей.
- Для достижения оптимальных результатов необходимо строго контролировать параметры обработки и инкубации образцов.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:18
Preparing Formalin‐Fixed Human Brain Sections for SHORT Tissue Transformation Technique
2:01
SWITCH ‐ H2O2 ‐ Antigen Retrieval — TDE (SHORT) Tissue Transformation Technique
4:55
Sample Mounting for Light‐Sheet Fluorescence Microscopy and Stripping for Multi‐Round Labeling of the Same Specimens
