Сбор данных о кристаллизации и комнатной температуре in situ с использованием кристаллизационной установки Harwell и Beamline VMXi, алмазного источника света
8 марта 2024 г.
Мы представляем протокол кристаллизации белков с использованием кристаллизационной установки в исследовательском комплексе в Харвелле и последующего сбора рентгеновских кристаллографических данных in situ с кристаллов внутри пластин на пучковой линии универсальной макромолекулярной кристаллографии in situ (VMXi) компании Diamond. Мы описываем требования к образцам, протоколы кристаллизации и рекомендации по сбору данных.
Понимание трехмерных структур белков лежит в основе разработки лекарств, биотехнологии и нашего понимания многих различных заболеваний. VMXI определяет структуры белков без криоохлаждения, что намного ближе к их естественным температурам. VMXI также измеряет дифракционные данные от кристаллов белка еще в их кристаллизационных пластинах, избегая каких-либо повреждений от механического обращения.
В будущем мы действительно хотим использовать невероятную пропускную способность VMXI для исследования больших популяций кристаллов, чтобы идентифицировать множество различных структурных состояний, а не одну структуру, которую люди часто получают сейчас. Мы также хотим продвинуться в направлении разработки лекарств и проведения скрининга фрагментов и оптимизации кристаллизационных планшетов. Новый подход, который показывает огромные перспективы.
Обзор
В данной статье представлен протокол кристаллизации белков и сбора рентгеноструктурных данных in situ. Метод предполагает использование линии VMXi для анализа структур белков при естественных температурах, что позволяет глубже понять механизмы их поведения.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Структурная биология
- Кристаллография
- Анализ белков
Теоретические сведения
- Понимание структур белков имеет решающее значение для разработки лекарственных препаратов и исследования заболеваний.
- Традиционные методы часто предполагают криоохлаждение, которое может изменять состояния белков.
- Система VMXi позволяет собирать данные непосредственно с планшетов для кристаллизации.
- Такой подход сводит к минимуму повреждения кристаллов при механическом воздействии.
Цель исследования
- Разработать протокол для эффективной кристаллизации белков.
- Использовать возможности VMXi для высокопроизводительного структурного анализа.
- Исследовать несколько структурных состояний белков для получения более детального представления.
Используемые методы
- Кристаллизация белков в планшетах NC2.
- Использование системы ISPyB для управления заявками и отправками.
- Сбор данных на линии VMXi при температуре 20 °C.
- Автоматизированная визуализация и анализ капель кристаллизации.
Основные результаты
- Успешный сбор дифракционных данных без криогенного охлаждения.
- Идентификация кристаллических объектов с помощью оценки CHiMP.
- Эффективное управление группами образцов и процессами сбора данных.
- Повышенная пропускная способность для исследования различных структур белков.
Выводы
- Данный протокол обеспечивает высокопроизводительную кристаллизацию и анализ белков.
- Подход VMXi обладает значительными преимуществами по сравнению с традиционными методами.
- Этот метод открывает широкие перспективы для будущей разработки лекарственных препаратов и исследований в области структурной биологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Кристаллография in situ при комнатной температуре на установке VMXi обеспечивает быстрый и высокопроизводительный структурный анализ белков, что способствует поиску лекарственных кандидатов на ранних стадиях и снижению рисков при изучении механизмов действия. Прямой сбор данных с планшетов для кристаллизации сводит к минимуму артефакты, возникающие при манипуляциях с образцами, и ускоряет получение обратной связи о результатах кристаллизации, повышая точность прогнозов в исследованиях и разработках на основе структуры. Этот рабочий процесс предназначен для оптимизации валидации мишеней и фрагментного скрининга, а глобальный удаленный доступ позволяет продвигать портфели проектов в масштабах всего предприятия.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишеней
- Позволяет проводить прямой структурный анализ белков при температурах, близких к физиологическим, для функциональной валидации мишени.
- Обеспечивает быструю проверку гипотез за счет получения мгновенных данных о состоянии кристаллизации и связывании лигандов.
- Способствует снижению механистических рисков путем фиксации нескольких конформационных состояний в популяциях кристаллов.
- Повышает достоверность прогнозов для последующего дизайна лекарственных средств за счет минимизации артефактов, вызванных криозаморозкой.
Скрининг и разработка анализа
- Подготавливает валидированные системы кристаллизации для скрининга и оптимизации фрагментов в планшетах.
- Стандартизирует рабочие процессы визуализации и сбора данных с использованием автоматизированной идентификации кристаллов на основе машинного обучения.
- Обеспечивает воспроизводимые количественные структурные результаты для надежной оценки соединений.
- Масштабируется до высокопроизводительного скрининга благодаря сбору данных на основе очередей и автоматизированному объединению данных.
Трансляционные и доклинические исследования
- Позволяет согласовать сбор структурных данных с условиями, релевантными для заболевания, за счет исключения артефактов криоохлаждения.
- Обеспечивает трансляционную непрерывность от этапа поиска до доклинической валидации благодаря поддержке серийной кристаллографии.
- Снижает риски при разработке за счет возможности быстрой оценки связывания лигандов и динамики белков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод объединяет этапы от раннего поиска до идентификации ведущего соединения, обеспечивая возможность дизайна на основе структуры и скрининга фрагментов в рамках единого, удаленно доступного рабочего процесса.
- Открытия в биологии: ускоряет проверку гипотез и уточнение путей за счет обеспечения быстрого определения структуры без образования артефактов.
- Скрининг: предоставляет готовые к анализу воспроизводимые платформы для кристаллизации с автоматизированной визуализацией и сбором данных.
- Аналитика: предоставляет количественные данные дифракции и автоматизированное объединение для надежного сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: поддерживает преемственность доклинических исследований за счет фиксации структур белков в условиях, близких к нативным.
- Корпоративное повторное использование: предлагает масштабируемую, удаленно доступную инфраструктуру для повторяющихся структурных кампаний в рамках различных программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозов и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней.
- Операционная ценность: стандартизирует и автоматизирует рабочие процессы кристаллизации, визуализации и сбора данных.
- Стратегическая ценность: обеспечивает более быстрое принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективно распределяет капитал при развитии портфеля.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации с учетом рисков и ускоренному продвижению структурно валидированных мишеней.
Особенности реализации
- Требуется экспертный опыт в области кристаллизации белков и интерпретации данных структурной биологии.
- Необходим доступ к автоматизированным системам визуализации, методам идентификации кристаллов на основе машинного обучения и инфраструктуре синхротронных линий.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов отслеживания образцов, управления данными и удаленного доступа.
- Адаптация метода для различных белковых мишеней и условий кристаллизации может потребовать оптимизации протокола.
- Пропускная способность и качество данных зависят от подготовки образцов и совместимости планшетов с автоматизированными системами.
