Микрокомпьютерный томографический анализ коленного сустава у морских свинок Данкина-Хартли в возрасте после внутрисуставной инъекции

Остеоартрит, или ОА, — это дегенеративное заболевание суставов, которым страдают 32,5 миллиона взрослых американцев. Часто симптомы ОА появляются только после того, как болезнь перешла в тяжелую форму. Нехватка модифицирующих болезнь препаратов связана с плохим пониманием механизмов, инициирующих и управляющих болезнью.

В результате, существует критическая и постоянная медицинская потребность в улучшенных препаратах для лечения остеоартрита. Морские свинки Данкина-Хартли являются признанной животной моделью ОА, поскольку у них естественным образом развивается это заболевание, предлагая надежную модель для исследования влияния новых терапевтических средств, вводимых путем внутрисуставной инъекции, на прогрессирование заболевания. Поскольку минерализованная кость имеет превосходный контраст на микро-КТ, этот метод может быть использован для оценки 3D-характеристик и выполнения количественного анализа изменений, связанных с ОА. Два особенно важных количественных показателя включают минеральную плотность костной ткани и трабекулярную толщину, поскольку оба показателя увеличиваются на протяжении всего прогрессирования заболевания. Описанная методика внутрисуставных инъекций морским свинкам и последующий анализ данных микро-КТ поможет снизить вариабельность исследований и повысить эффективность анализа данных.

Побрейте колено электрической бритвой. Обезболить животное и подтвердить достаточную глубину анестезии отсутствием реакции на защемление пальца ноги. Поместите стерильную глазную смазку в оба глаза, чтобы предотвратить высыхание и травмы.

Очистите место инъекции три раза круговыми движениями и чередуйте с использованием разбавленного скраба и спиртовых растворов. Следует использовать стерильные перчатки. В этом видео рассказывается об использовании автоклавных нитроперчаток.

На протяжении всей процедуры следует использовать асептическую технику. Согните колено до 90 градусов, переместите палец дистальнее коленной чашечки, чтобы найти борозду дистального отдела суставного пространства, сгибая и разгибая заднюю конечность. Большеберцовая кость может прощупываться как костная структура, расположенная дистальнее надколенника.

После того, как местоположение большеберцовой кости и надколенника определено, сустав оказывается между ними. Осторожно введите иглу инсулина по средней линии дистальнее надколенника в пределах суставной щели. Игла должна быть введена на один-два миллиметра ниже кожи.

Медленно вводите объем. Массируйте колено, сгибая и разгибая сустав несколько раз, чтобы обеспечить правильное распределение препарата. Поместите образцы с формалином в совместимую емкость.

Откалибруйте аппарат микрокомпьютерной томографии для воздействия темного и светового поля в соответствии с рекомендациями производителя. Отсканируйте образец с помощью алюминиево-медного фильтра на глубине 18 мкм. Используйте шаг поворота 0,7 градуса на 360 градусов со смещенной камерой.

Выберите один срез из изображений микрокомпьютерной томографии. Проверьте компенсацию смещения. В разделе «Настройки» примените сглаживание, упрочнение луча, вращение CS и кольцевой артефакт.

Нажмите кнопку Начать, чтобы начать восстановление. Выберите VOI и ориентируйте образец так, чтобы он был выровнен по вертикали для упрощения анализа в дальнейшем. Сохраните отредактированный VOI как новую папку.

Выберите диапазон изображений для анализа, начиная с субхондральной пластины. Расщепление субхондральной пластинки в трабекулярной кости рекомендуется проводить из-за того, что они имеют разные костные особенности. Выберите область интереса для каждого изображения, чтобы убедиться, что она охватывает кость.

Выберите двоичное выделение. Отрегулируйте гистограмму так, чтобы фон в кости был полностью отдельным. Выберите вкладку минеральной плотности костной ткани.

Сохраните эти данные в новой папке с данными анализа. Выберите пользовательскую обработку. Сначала выполните пороговое значение и выберите Автоматически, а затем выполните.

Затем выберите Удалить пятнышки и выберите Удалить черные пятнышки. Повторите Удаление пятнышек и в появившемся появившемся окне, выберите опцию Удалить белые пятнышки. Выберите 3D анализ и выберите базовые и дополнительные величины.

А показывает рассеченное колено с присутствием красителя метиленового синего в суставной щели, что указывает на правильную инъекцию. В – это неглубокая инъекция, в результате которой в подкожном пространстве образуется пузырь. C показывает отсутствие метиленового синего красителя в суставной щели, что указывает на неправильную инъекцию.

Может быть полезно разделить анализ для субхондральной пластинки, которая показана в А, и трабекулярной кости, которая показана в В, поскольку иногда они имеют разные параметры для разных анализов костей. Что касается минеральной плотности костной ткани, мы видим, что среднее значение у 12-месячных морских свинок увеличивается по сравнению с пятимесячными морскими свинками, и это верно как для субхондральной пластинки, так и для трабекулярной кости, что показывает, что минеральная плотность костной ткани увеличивается с течением времени. В дополнение к толщине трабекуляра, мы видим, что между 12-месячной морской свинкой и девятимесячной морской свинкой и пятимесячной морской свинкой увеличивается толщина в миллиметрах, что показывает, что трабекулярная толщина увеличивается с течением времени.

Модифицированные баллы Манкина увеличиваются по мере старения морских свинок, как видно на рисунке A. На рисунках от B до D показаны синие пятна толуидина. B — пятимесячная морская свинка, C — девятимесячная морская свинка, а D — 12-месячная морская свинка. Черная звездочка на рисунке C показывает потерю протеогликанов, в то время как черная звездочка на рисунке D показывает трещины, а белая звездочка на рисунке D показывает гипоцеллюлярность.

В настоящее время единственным лекарством от тяжелого ОА является замена, которая является дорогостоящей, инвазивной и может привести к заболеваемости и смертности пациентов. В результате, существует острая необходимость в продолжении исследований на животных моделях ОА и устойчивом развитии новых методов лечения. Несмотря на то, что внутрисуставные инъекции являются неотъемлемой частью исследований остеоартрита морских свинок, эта процедура еще не была систематизирована.

Надлежащие процедуры инъекций имеют первостепенное значение для обеспечения благополучия животных и сокращения общего поголовья животных, особенно в исследованиях, требующих многократных инъекций в течение многих месяцев. Для систематической оценки изменений, связанных с ОА, мы описываем микрокомпьютерную томографию. Микро-КТ обеспечивает более глубокую оценку изменений ОА, чем гистологический обзор сканирования всего образца, а не одного или нескольких срезов ткани.

В то время как морские свинки Данкина-Хартли представляют собой надежную модель для изучения прогрессирования ОА и эффектов новых методов лечения, у этой модели есть ограничения. Спонтанные модели обычно требуют более длительного периода исследования по сравнению с быстрым развитием изменений после хирургического или химически индуцированного ОА. Кроме того, исследователи могут уменьшить эффект межживотной изменчивости, применяя лечение к одной конечности у каждого животного, позволяя контралатеральной конечности служить внутренним контролем.