Использование визуализации живых клеток для измерения влияния патологических белков на аксональный транспорт в первичных нейронах гиппокампа
22 декабря 2023 г.
В этой статье мы демонстрируем, как сочетать трансфекцию первичных нейронов гиппокампа грызунов с конфокальной визуализацией живых клеток для анализа патологических белковых эффектов на аксональный транспорт и выявления механистических путей, опосредующих эти эффекты.
Нейроны полагаются на двунаправленный транспорт груза вдоль аксона для поддержания функционального синапса и нейронных связей. Считается, что дефицит транспорта является критическим фактором патогенеза нескольких нейродегенеративных заболеваний. Мы стремимся определить механизмы, с помощью которых ассоциированные с заболеванием модификации тау-белка нарушают аксональный транспорт.
Установлено, что множественные патологические формы тау-белка нарушают нормальный аксональный транспорт в нейронах млекопитающих. Этот эффект зависит от изменений в сигнальных путях на основе фосфорилирования, которые регулируют аксональный транспорт. Эти нарушения представляют собой потенциальный механизм нейротоксичности, вызванной тау-индуцизмом при заболевании.
Модифицированные формы специфических белков могут нарушать нормальный быстрый аксональный транспорт при нескольких нейродегенеративных заболеваниях. Тем не менее, мы не до конца понимаем основные механизмы этих эффектов. Это обеспечивает воспроизводимый и простой протокол для определения того, как экспрессия белков, связанных с заболеванием, влияет на быстрый аксональный транспорт в нейронах млекопитающих.
Этот протокол обеспечивает воспроизводимый анализ аксонального транспорта в первичных нейронах млекопитающих, который легко модифицируется для включения различных грузовых белков наряду с экспрессией представляющих интерес белков со специфическими патологическими модификациями. Это также позволяет целенаправленно сбивать другие компоненты пути для тестирования определенных механистических деталей.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной работе демонстрируется сочетание трансфекции первичных нейронов гиппокампа грызунов с конфокальной визуализацией живых клеток для изучения влияния патологических модификаций белков на аксональный транспорт. Цель исследования заключается в выявлении механистических путей, которые опосредуют нарушения, вызванные модификациями тау-белка при нейродегенеративных заболеваниях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Аксональный транспорт
- Нейродегенеративные заболевания
Теоретические основы
- Нейроны осуществляют двунаправленный транспорт грузов по аксонам для поддержания своей функциональности.
- Нарушения транспорта связаны с рядом нейродегенеративных заболеваний.
- Модифицированные формы тау-белка нарушают нормальные механизмы транспорта.
- Понимание этих механизмов может помочь выявить пути развития нейротоксичности, индуцированной тау-белком.
Цель исследования
- Выявить сигнальные пути, измененные патологическими модификациями tau-белка.
- Разработать протокол анализа аксонального транспорта в нейронах млекопитающих.
- Обеспечить возможность таргетного воздействия на различные белки, влияющие на механизмы транспорта.
Используемые методы
- Первичные нейроны гиппокампа были трансфицированы и проанализированы с помощью конфокальной микроскопии живых клеток.
- Протокол включает выделение тканей гиппокампа эмбриона мыши и последующее культивирование клеток.
- В представленном тексте мультиомные анализы не упоминаются.
- Критически важные этапы включают подготовку предметных стекол, трансфекцию нейронов и визуализацию через два дня после трансфекции.
- Ключевые методологические детали включают использование специфических настроек визуализации для наблюдения за аксональным транспортом.
Основные результаты
- Патологические формы тау-белка нарушают нормальную динамику аксонального транспорта.
- Нарушение транспорта связано с изменениями в путях фосфорилирования.
- Эти нарушения могут способствовать нейродегенерации.
- В исследовании разработан воспроизводимый подход к изучению изменений транспорта, вызванных патологическими белками.
Выводы
- В данном исследовании продемонстрирован метод анализа влияния модифицированных белков на нейрональный транспорт.
- Понимание этих механизмов позволяет глубже изучить нейрональную дисфункцию при различных патологиях.
- Полученные результаты могут расширить знания об аксональном транспорте при нейродегенеративных заболеваниях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Нарушение аксонального транспорта является общим механизмом в патогенезе нейродегенеративных заболеваний, что влияет на валидацию мишеней и снижение механистических рисков на ранних этапах разработки лекарств. Визуализация живых первичных нейронов гиппокампа позволяет количественно оценить, как патологические белки, такие как мутантный tau, изменяют динамику перемещения грузов, что повышает прогностическую достоверность в системах, релевантных заболеванию. Этот воспроизводимый рабочий процесс помогает в отборе и приоритизации мишеней при нейродегенерации путем выявления механистических недостатков.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет исследовать модификации белков, имеющие значение для заболевания, в механизмах нейронального транспорта.
- Поддерживает функциональную валидацию мишеней путем количественной оценки фенотипов нарушения транспорта.
- Способствует снижению механистических рисков при выборе мишеней для терапии нейродегенерации.
- Предоставляет платформу для тестирования стратегий сайленсинга генов или модуляции сигнальных путей.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет создать валидированный метод анализа живых клеток для количественной оценки аксонального транспорта в первичных нейронах.
- Обеспечивает воспроизводимые количественные данные, такие как скорость, частота пауз и плотность груза.
- Обеспечивает стандартизацию анализа для скрининга воздействия соединений или генетических пертурбаций.
- Поддерживает масштабируемость и адаптацию к дополнительным белкам, имеющим значение для патологий.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует нейрональным моделям заболеваний для поиска трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает преемственность от выявления механизмов до доклинической валидации фенотипов транспорта.
- Позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении программ по изучению нейродегенерации.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол визуализации живых клеток охватывает этапы от первичного поиска до идентификации ведущих соединений, обеспечивая проверку механистических гипотез и разработку анализов для мишеней нейродегенеративных заболеваний.
- Биология открытий: Количественная оценка влияния патологических модификаций белков на аксональный транспорт для выяснения механизмов развития заболеваний.
- Скрининг: Обеспечение стандартизированных и воспроизводимых показателей для скрининга соединений или генетических модификаций в первичных нейронах.
- Аналитика: Создание количественных метрик (скорость, частота пауз, плотность груза) для достоверного сравнения условий.
- Трансляционные исследования: Сохранение релевантности заболевания за счет использования первичных нейрональных систем и фенотипических показателей.
- Корпоративное повторное использование: Адаптивный протокол для изучения различных нейродегенеративных белков-мишеней и проведения механистических исследований.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую уверенность и снижает механистическую неоднозначность в исследованиях нейродегенерации.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые и масштабируемые рабочие процессы визуализации живых клеток.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), а также эффективно управлять портфелем проектов с точки зрения затрат капитала.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации и продвижению мишеней нейродегенерации с учетом скорректированных рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с первичными культурами нейронов и конфокальной визуализацией живых клеток.
- Необходим доступ к современному микроскопическому оборудованию и инструментам количественного анализа изображений (например, KymoAnalyzer).
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости данных.
- Метод применим к различным белкам, связанным с заболеваниями, и генетическим пертурбациям.
- Ограничено системами первичных нейронов in vitro; может не учитывать все сложности условий in vivo.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:30
Harvesting of Primary Hippocampal Neurons for Live‐Cell Imaging
4:06
Primary Hippocampal Neuron Dissociation and Plating for the Measurement of the Effects of Pathological Proteins on Axonal Transport
6:38
Live‐Cell Imaging of Primary Hippocampal Neurons for the Measurement of the Effects of Pathological Proteins on Axonal Transport
