Изготовление стрептавидин-аффинной сетки для пробоподготовки методом криоэлектронной микроскопии
29 декабря 2023 г.
Представлен пошаговый протокол изготовления аффинных сеток стрептавидина для использования в структурных исследованиях сложных образцов макромолекул методом криоэлектронной микроскопии.
В последнее время в области крио-ЭМ было достигнуто много технологических достижений, в том числе усовершенствования в самом аппаратном обеспечении микроскопа, которые улучшают общее качество изображений, а также разработки в программном обеспечении, которое используется для обработки крио-ЭМ изображений, которое может начать работать с большим количеством гетерогенности, присутствующей во многих образцах. Пробоподготовка остается одним из самых узких мест в крио-ЭМ. Количество образца может быть предельным, и белки имеют тенденцию поглощаться к гидрофобной границе воздух-вода во время витрификации.
Это может привести к денатурации образца, разрушению более крупных белковых комплексов и предпочтительной ориентации частиц, которые присутствуют на крио-ЭМ изображениях. Эти сетки используют преимущества высокоаффинного взаимодействия между стрептавидином и биотином для связывания биотинилированных образцов и защиты их от гидрофобной границы раздела воздух-вода. Мы можем работать с очень малыми объемами образцов, а случайное выделение образцов биотином предлагает стратегию преодоления проблем с предпочтительной ориентацией, которые могут наблюдаться при использовании других вспомогательных слоев.
Обзор
В данной статье представлен подробный протокол изготовления сеток с аффинным связыванием стрептавидина, которые необходимы для структурных исследований сложных макромолекулярных образцов с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ). Описанный метод позволяет решить распространенные проблемы подготовки образцов, такие как денатурация белков и преимущественная ориентация молекул.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Криоэлектронная микроскопия
- Структурная биология
- Макромолекулярный анализ
Теоретические сведения
- Последние достижения в области криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) позволили улучшить качество изображений.
- Подготовка образцов является основным сдерживающим фактором в рабочих процессах крио-ЭМ.
- Белки могут подвергаться денатурации или приобретать преимущественную ориентацию в процессе подготовки образцов.
- Взаимодействия стрептавидина и биотина позволяют стабилизировать образцы и минимизировать эти проблемы.
Цель исследования
- Предоставить надежный протокол подготовки сеток с аффинной привязкой к стрептавидину.
- Повысить качество изображений криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) за счет снижения денатурации образца.
- Решить проблему преимущественной ориентации образцов при крио-ЭМ.
Используемые методы
- Очистка и подготовка стеклянных шприцев и сеток с использованием этанола и хлороформа.
- Создание липидных монослоев для стабилизации биотинилированных образцов.
- Инкубация сеток со стрептавидином и промывка для удаления несвязавшихся белков.
- Использование углеродного напыления для подготовки сеток к визуализации.
Основные результаты
- Согласно данному протоколу, были успешно подготовлены сетки, сохранившие целостность образца.
- На микрофотографиях виден непрерывный рисунок сетки, что указывает на эффективное формирование решетки.
- Анализ с помощью быстрого преобразования Фурье подтвердил удаление сигналов стрептавидина.
- Данный метод позволяет использовать небольшие количества образца без потери качества.
Выводы
- Протокол использования сеток с аффинитетом к стрептавидину эффективен для криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ).
- Данный подход позволяет значительно улучшить анализ сложных макромолекулярных образцов.
- Будущие применения могут способствовать дальнейшему развитию исследований в области структурной биологии.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для отрасли
Изготовление сеток с помощью стрептавидинового сродства позволяет устранить постоянные трудности при подготовке образцов для крио-ЭМ, обеспечивая высокоточное структурное определение макромолекул при ограниченном количестве доступного материала. Минимизируя денатурацию и артефакты ориентации на границе раздела фаз воздух-вода, данный метод повышает достоверность прогнозов в процессах раннего поиска и структурной биологии. Его надежный протокол способствует широкому внедрению метода в организациях для работы со сложными мишенями и комплексными сборками.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет проводить структурный анализ малораспространенных или нестабильных белковых комплексов.
- Снижает механистическую неопределенность за счет сохранения нативных конформаций в процессе витрификации.
- Способствует функциональной валидации мишеней благодаря повышению целостности образцов.
- Облегчает сортировку портфеля мишеней, предоставляя надежные структурные данные для труднодоступных объектов.
Скрининг и разработка методов анализа
- Позволяет подготавливать валидированные сетки для криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) для последующих высокопроизводительных рабочих процессов визуализации.
- Повышает воспроизводимость анализа за счет минимизации потерь образца и устранения эффекта ориентационного смещения.
- Обеспечивает количественные структурные показатели, необходимые для оценки соединений.
- Позволяет повторно использовать платформу для различных биотинилированных мишеней и комплексов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Позволяет сопоставлять структурные данные с биомолекулярными ансамблями, имеющими значение для заболевания, где это применимо.
- Обеспечивает преемственность от этапа характеристики при поиске до доклинической валидации.
- Снижает риски при трансляционном продвижении путем подтверждения молекулярной целостности в условиях крио-ЭМ.
- Поддерживает принятие решений с учетом рисков для сложных биопрепаратов и модальностей.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный протокол изготовления объединяет этапы подготовки образцов и структурного анализа, связывая стадии первичного поиска и идентификации ведущих соединений для структурно сложных мишеней.
- Биологические исследования: обеспечивает платформу для проверки гипотез и уточнения путей с помощью визуализации высокого разрешения.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимую количественную подготовку сеток для надежного последующего анализа.
- Аналитика: позволяет проводить надежное измерение формирования решетки и целостности образцов с помощью анализа микрофотографий и БПФ.
- Трансляционные исследования: способствует преемственности на доклиническом этапе, поддерживая структурные исследования комплексов, имеющих значение для патологии.
- Корпоративное повторное использование: предлагает стандартизированный, многократно используемый рабочий процесс подготовки биотинилированных образцов для различных программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистические риски в структурных исследованиях.
- Операционная ценность: Стандартизирует подготовку сеток, улучшая воспроизводимость и масштабируемость между исследовательскими группами.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает более обоснованное принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки за счет предоставления надежных данных по сложным мишеням.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию с учетом рисков и продвижение структурно сложных активов.
Особенности реализации
- Требуется технический опыт работы с сетками для криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) и химией биотинилирования.
- Необходим доступ к специализированному оборудованию для изготовления сеток и напыления углерода.
- Рекомендуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости и поддержки при устранении неполадок.
- Метод применим к различным биотинилированным белкам и комплексам, однако для новых мишеней может потребоваться оптимизация.
- Ограниченное коммерческое предложение делает необходимым внедрение собственного протокола и соответствующее обучение персонала.
