Генерация и последующий анализ одноклеточных и одноядерных транскриптомов в органоидах мозга
29 марта 2024 г.
В этой статье мы представляем комплексный протокол для генерации и последующего анализа органоидов человеческого мозга с использованием секвенирования одиночных клеток и одноядерных РНК.
Мы разрабатываем и оптимизируем модели органоидов для того, чтобы применять их для моделирования заболеваний. Наша цель состоит в том, чтобы понять молекулярный механизм, лежащий в основе развития и прогрессирования заболевания, и мы работаем в тесном сотрудничестве с лабораторией Николауса Раевского, которая разрабатывает и применяет одноклеточные и пространственные технологии, чтобы понять, как РНК регулирует экспрессию генов в норме и при заболеваниях. В последние годы органоиды мозга стали экспериментальными и трансляционными платформами для изучения заболеваний, специфичных для пациентов.
Поэтому неудивительно, что большинство последних разработок направлены на повышение сложности моделей органоидов мозга. Например, теперь мы можем генерировать органоиды, специфичные для областей мозга, а также использовать органоиды мозга для создания мультиорганоидных сборок. Кроме того, были реализованы различные методы введения васкуляризации и иммунных клеток в органоиды мозга.
В настоящее время одной из наиболее продвинутых технологий, которые мы используем в этой лаборатории, является пространственная транскриптомика, которая позволяет оценить экспрессию генов в интактных тканях. Это имеет решающее значение для понимания того, как профили экспрессии генов разных типов клеток изменяются в разных областях одной ткани. Еще одним недавним достижением является мультиомика одиночных ячеек, которая позволяет анализировать несколько модулей одной ячейки, что дает более целостный подход к анализу этих ячеек.
Мы используем органоиды мозга и методы одноклеточной и пространственной транскриптомики, чтобы понять основные механизмы заболеваний человека, таких как синдром Ли и энцефалит простого герпеса. Кроме того, мы разработали методы пространственной транскриптомики с высоким разрешением и с высоким уровнем затрат, получившие название Open-ST. Мы сравнили и оптимизировали метод секвенирования одиночных и одноядерных РНК, чтобы понять, насколько хорошо они эффективны в отношении восстановления типа клеток в органоидной ткани мозга.
Обзор
В данной статье представлен комплексный протокол создания органоидов человеческого мозга и их анализа с помощью секвенирования РНК отдельных клеток. Целью данного исследования является совершенствование моделирования заболеваний с помощью передовых методов создания органоидов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Технология органоидов
- Секвенирование РНК
Введение
- Органоиды мозга служат платформами для изучения заболеваний конкретных пациентов.
- Последние достижения сосредоточены на увеличении сложности моделей органоидов.
- Сотрудничество с лабораторией Николауса Раевски расширяет понимание регуляции РНК.
- Органоиды могут быть созданы для представления конкретных областей мозга.
Цель исследования
- Разработка органоидных моделей для моделирования заболеваний.
- Исследование молекулярных механизмов развития и прогрессирования заболеваний.
- Повышение сложности моделей органоидов мозга для получения более точных результатов исследований.
Используемые методы
- Создание органоидов человеческого мозга.
- Секвенирование РНК отдельных клеток для анализа.
- Сотрудничество со специализированными лабораториями для применения передовых методов.
- Сборки из нескольких органоидов для комплексных исследований.
Основные результаты
- Успешное создание органоидов, специфичных для определенных областей мозга.
- Углубленное понимание роли РНК в экспрессии генов.
- Разработка мультиорганоидных систем для моделирования сложных заболеваний.
- Выявление молекулярных механизмов развития заболеваний.
Выводы
- Органоиды мозга представляют большую ценность для изучения механизмов заболеваний.
- Усовершенствованные модели органоидов могут способствовать более глубокому пониманию болезней.
- Сотрудничество и интеграция технологий являются ключевыми факторами прогресса.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Транскриптомный анализ отдельных клеток и отдельных ядер в органоидах мозга позволяет проводить высокоразрешающее картирование клеточного разнообразия и экспрессии генов, что напрямую способствует моделированию заболеваний и снижению механистических рисков в нейробиологии. Эти подходы обеспечивают прогностическую уверенность при валидации мишеней и исследовании сигнальных путей на ранних этапах поиска, особенно для сложных и гетерогенных тканей. Интеграция данных методов в процессы НИОКР ускоряет получение трансляционных выводов и принятие решений по портфелю с учетом рисков при разработке препаратов для лечения заболеваний ЦНС.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать значимые для заболевания пути и клеточную гетерогенность в моделях мозга человека.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней за счет дифференциации нейрональных и ненейрональных типов клеток с одноклеточным разрешением.
- Способствует механическому снижению рисков путем установления связи между профилями экспрессии генов и фенотипами заболеваний.
- Повышает прогностическую уверенность при продвижении мишеней по конвейеру разработки.
Скрининг и разработка методов анализа
- Подготавливает валидированные системы органоидов для последующего скрининга соединений и функциональной геномики.
- Стандартизирует протоколы диссоциации и изоляции ядер для обеспечения воспроизводимости и получения количественных результатов.
- Обеспечивает масштабируемую подготовку библиотек и рабочие процессы секвенирования для высокопроизводительного анализа.
- Предоставляет надежные наборы данных для достоверной оценки потенциальных методов терапевтического вмешательства.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит транскриптомные профили органоидов в соответствие с биомаркерами, имеющими значение для заболевания, для обеспечения трансляционной преемственности.
- Поддерживает моделирование специфических для конкретного пациента и конкретного региона расстройств ЦНС в доклинических условиях.
- Позволяет принимать решения о продвижении исследований с учетом рисков путем установления связи между молекулярными механизмами и фенотипическими результатами.
- Способствует интеграции мультиомных данных и пространственной транскриптомики для комплексного моделирования заболеваний.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Транскриптомика отдельных клеток и отдельных ядер позволяет использовать органоиды мозга в качестве связующего звена в исследованиях ЦНС — от этапа первичных открытий и идентификации перспективных соединений до доклинической валидации.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей путем определения экспрессии генов, специфичной для конкретного типа клеток.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные транскриптомные данные для разработки анализа и приоритизации соединений.
- Аналитика: предоставляет многомерные наборы данных для сравнительного анализа экспериментальных условий и моделей заболеваний.
- Трансляционные исследования: сопоставляет молекулярные сигнатуры в органоидах с клиническими биомаркерами для повышения трансляционной значимости.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу для моделирования различных заболеваний ЦНС и проведения механистических исследований.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования и снижает механистическую неоднозначность при валидации мишеней в ЦНС.
- Операционная ценность: стандартизирует протоколы для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости между исследовательскими группами.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективно управлять портфелем активов.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации программ по ЦНС и их развитию с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами органоидов, их диссоциацией и рабочими процессами секвенирования единичных клеток или ядер.
- Необходим доступ к платформам секвенирования на основе микрофлюидики и передовой аналитической инфраструктуре.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов для обеспечения сопоставимости данных.
- Может потребоваться адаптация для различных моделей органоидов или контекстов заболеваний.
- Результат зависит от высококачественной подготовки образцов для обеспечения достоверности последующего анализа.
