Быстрое количественное определение окисленных и восстановленных форм глутатиона с использованием орто-фтальдегида в культивируемых клетках млекопитающих in vitro
28 июня 2024 г.
Количественное определение как окисленных, так и восстановленных форм глутатиона (GSSG и GSH соответственно) было достигнуто за счет использования ортофтальдегида (OPA). OPA становится высокофлуоресцентным после конъюгации с GSH, но не может конъюгировать GSSG до тех пор, пока не восстановится. Здесь мы описываем многопараметрический анализ для количественной оценки обоих с использованием количественного определения белка для нормализации.
Мы стремимся предложить новые способы количественной оценки концентрации тиола с особым акцентом на концентрации GSH и GSSG различных клеточных линий, которые могут быть выполнены in situ. Мы считаем это полезным протоколом для научного сообщества. Были предприняты многочисленные усилия по выявлению нишевых и специфических биомаркеров, представляющих интерес для активных форм кислорода, и некоторые из них обнаружили большой интерес к обнаружению короткоживущих активных форм кислорода, таких как радикальная детекция и малые молекулы, такие как гидроксилы и синглетный кислород.
Одной из ключевых проблем для нескольких учреждений была возможность точно и конкретно обнаруживать интересующие биомаркеры без необходимости использования дорогостоящего оборудования или трудоемких процессов. Этот протокол позволяет проводить многопараметрический анализ, что позволяет нормализовать данные без необходимости использования отдельных протоколов и удалять несколько стадий, обнаруженных в других анализах, которые требуют много времени, содержат несовместимые реагенты или используют реагенты, опасные для здоровья. Группа по безопасности наноматериалов продолжит оценку различных наноматериалов и полимеров на предмет их влияния на здоровье человека.
Мы считаем этот протокол неотъемлемой частью нашего инструментария для достижения этой цели, поскольку этот протокол потенциально может быть мультиплексирован для обнаружения дополнительных биомаркеров.
Обзор
В данном исследовании представлен новый протокол для количественного определения концентраций восстановленного (GSH) и окисленного (GSSG) глутатиона в различных клеточных линиях. В методе используется орто-фтальальдегид (OPA) для флуоресцентного детектирования, что позволяет эффективно проводить нормализацию данных без необходимости в трудоемких процедурах.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биохимия
- Клеточная биология
Теоретическая база
- Активные формы кислорода являются важными биомаркерами в различных биологических процессах.
- Точное определение GSH и GSSG имеет решающее значение для понимания окислительного стресса.
- Существующие методы могут быть дорогостоящими и трудоемкими.
- Данный протокол направлен на упрощение процесса количественного определения.
Цель исследования
- Обеспечить надежный метод количественного определения концентраций GSH и GSSG.
- Облегчить проведение анализа in situ в различных клеточных линиях.
- Снизить сложность и время, затрачиваемые на выполнение существующих анализов.
Используемые методы
- Приготовление стандартов GSH и калибровочных кривых.
- Промывка и инкубация клеточных осадков со специфическими реагентами.
- Использование OPA для флуоресцентного детектирования глутатиона.
- Измерение флуоресценции при заданных длинах волн возбуждения и эмиссии.
Основные результаты
- Клетки A-549 демонстрировали различные соотношения GSH/GSSG при воздействии различных наноматериалов.
- Наивысшие уровни GSSG наблюдались при воздействии серебра в концентрации 125 µg/mL.
- Анализ продемонстрировал эффективную нормализацию количественного определения белков.
- Результаты указывают на возможность использования мультиплексного анализа для обнаружения дополнительных биомаркеров.
Выводы
- Данный протокол предлагает оптимизированный подход к количественному определению глутатиона.
- Его можно интегрировать в более широкие исследования окислительного стресса и биомаркеров.
- Метод доступен и не требует дорогостоящего оборудования.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Количественная оценка восстановленного и окисленного глутатиона в культурах клеток млекопитающих имеет решающее значение для анализа окислительно-восстановительного статуса клеток и ответа на окислительный стресс на ранних этапах разработки лекарственных препаратов. Данный анализ на основе OPA позволяет проводить быстрое мультиплексное количественное определение GSH и GSSG, обеспечивая надежный анализ биомаркеров без необходимости использования специализированного оборудования. Совместимость данного протокола с методами нормализации и анализа цитотоксичности упрощает интеграцию данных в рабочих процессах поиска и доклинических исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет проводить прямое измерение антиоксидантной способности клеток для механистического снижения рисков.
- Обеспечивает функциональную валидацию путей окислительного стресса в моделях, релевантных для конкретных заболеваний.
- Способствует быстрому тестированию гипотез относительно взаимодействия с мишенью и модуляции сигнальных путей.
Скрининг и разработка методов анализа
- Обеспечивает стандартизированный количественный анализ для высокопроизводительного скрининга соединений.
- Позволяет проводить воспроизводимую оценку модуляции окислительно-восстановительных процессов в различных клеточных линиях.
- Объединяет нормализацию по белку и оценку цитотоксичности для получения многопараметрических результатов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Согласует количественное определение биомаркеров окислительного стресса с трансляционными конечными точками.
- Обеспечивает преемственность от этапа поиска in vitro до валидации на доклинических моделях.
- Обосновывает решения о переходе к следующим этапам разработки с учетом рисков на основе клеточного редокс-статуса.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод количественного определения глутатиона на основе OPA применим на этапах от раннего поиска до доклинических исследований, что позволяет легко интегрировать анализ редокс-биомаркеров в процессы идентификации перспективных соединений и изучение механизмов действия.
- Открывающая биология: обеспечивает возможность проверки гипотез о путях окислительного стресса и валидацию мишеней.
- Скрининг: предоставляет количественные, воспроизводимые результаты, подходящие для сортировки соединений и стандартизации анализа.
- Аналитика: обеспечивает надежные измерения на основе флуоресценции для сравнительного анализа редокс-статуса клеток.
- Трансляционные исследования: связывают результаты in vitro с доклиническими стратегиями поиска биомаркеров в случаях, когда окислительный стресс является значимым конечным показателем.
- Корпоративное использование: предлагает масштабируемую, адаптируемую платформу для количественного определения редокс-биомаркеров в рамках нескольких программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозирования при модуляции путей окислительного стресса и валидации мишеней.
- Операционная ценность: Снижает сложность анализа, затраты времени и использование опасных реагентов, обеспечивая при этом получение мультиплексных данных.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) за счет интеграции редокс-биомаркеров с данными о цитотоксичности и нормализации белков.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию активов с учетом рисков на основе механистических данных и показателей биомаркеров.
Особенности реализации
- Требуется опыт в постановке флуоресцентных анализов и интерпретации данных.
- Необходим доступ к флуоресцентному планшетному ридеру и стандартной инфраструктуре для культивирования клеток.
- Требуется межкомандная стандартизация для нормализации данных и интеграции оценки цитотоксичности.
- Метод адаптируем к различным линиям клеток млекопитающих при условии оптимизации протокола по мере необходимости.
- Возможность мультиплексирования для анализа дополнительных биомаркеров зависит от совместимости реагентов и валидации.
