Окрашивание Picrosirius Red для полуколичественной гистопатологической оценки отложения коллагена у мышей моделей хронического отторжения аллотрансплантата легкого
21 марта 2025 г.
Окрашивание Picrosirius Red является полуколичественным методом для объективной оценки отложения коллагена при мышином легочном фиброзном ремоделировании в пространственном разрешении. Помимо оценки общего отложения коллагена, окрашивание Picrosirius Red позволяет дифференцировать коллагеновые волокна разной толщины.
Наше исследование сосредоточено на анализе развития фиброза при хроническом отторжении аллотрансплантата легкого. Поэтому нас интересуют методы, которые характеризуют фиброзный тканевый компартмент. Для воспроизведения заболеваний, связанных с трансплантацией, мы используем мышиную модель трансплантации одного легкого, которую мы представили несколько лет назад.
В этой модели было показано, что трансплантация легкого между аллогенными линиями мышей приводит к различным уровням фиброза трансплантата. Гистологические данные по ремоделированию фиброзной ткани часто представлены качественно. Наш метод окрашивания Picrosirius Red дает преимущество полуколичественной оценки и позволяет дифференцировать толстые и тонкие коллагеновые волокна.
Для начала увлажните образцы легких мыши, содержащие парафин, в уменьшающейся концентрации этанола в течение двух минут каждый. Окрасьте предметное стекло на восемь минут в раствор гемалума Мейера. Промойте предметное стекло в течение 10 минут под проточной водой из-под крана, затем выдержите предметное стекло в течение одного часа в растворе Picrosirius Red.
Опустите предметное стекло от пяти до 10 раз в 0,5% раствор уксусной кислоты. Осторожно встряхните предметное стекло, чтобы удалить раствор. Теперь обезвожьте предметное стекло в возрастающей концентрации этанола и 100% ксилола в течение пяти минут каждого.
Добавьте одну каплю монтажного носителя на образец для встраивания и накройте крышкой. Дайте предметным стеклам высохнуть под вытяжным шкафом. Под световым микроскопом используйте соответствующее программное обеспечение для фокусировки образца до тех пор, пока не будет получено четкое и четкое изображение.
Регулируйте степень поляризационного фильтра до тех пор, пока фон не станет полностью темным или черным. Отсканируйте образец с 20-кратным увеличением и экспортируйте изображения в формат TIFF. Перенесите изображения в программное обеспечение Fiji.
Нажмите кнопку Редактировать и выберите Очистить снаружи. Затем нажмите «Анализировать», а затем «Измерить», чтобы измерить общую площадь поверхности. Чтобы измерить общее содержание коллагена в образце, нажмите «Изображение», а затем «Настройка» и «Порог цвета».
Установите оттенок от 2 до 130 и яркость от 35 до 255. Затем нажмите «Анализ» и в окне «Анализ частиц» установите размер на 1 минус бесконечность и отметьте галочками поля «Очистить» и «Суммировать». Отрегулируйте оттенок на красный для анализа толстых коллагеновых волокон и желтый зеленый для тонких коллагеновых волокон, а также измерьте общее количество коллагена.
Наконец, нажмите «Подключаемые модули», «Макросы» и «Запись», чтобы настроить макрос для автоматической обработки. Окрашивание по трихрому Массона, Херовичи и Picrosirius Red проиллюстрировало обширное отложение парабронхиального и параваскулярного коллагена в несогласованной модели основного комплекса гистосовместимости. Незначительная несогласованная модель в первую очередь показала плотные лимфоцитарные инфильтраты с менее интенсивным отложением коллагена.
Окрашивание Picrosirius Red с помощью поляризационного фильтра показало зеленый вид отложенных волокон на обеих моделях. Контроль изотрансплантата показал, что коллаген ограничен парабронхиальными и параваскулярными границами, подобно наивным мышиным легким. Анализ цифровых изображений выявил повышенное содержание общего коллагена в несоответствующих трансплантатах большого комплекса гистосовместимости по сравнению с незначительными несовпадающими трансплантатами, правосторонней наивной легочной тканью или наивными левыми легкими BALB/c.
Различий в толстых коллагеновых волокнах не выявлено. Анализ тонких коллагеновых волокон показал повышенное присутствие в основной несоответствующей модели по сравнению с незначительной несоответствующей моделью, наивной правосторонней легочной тканью или наивной левой легкой BALB/c.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании изучается развитие фиброза при хроническом отторжении аллотрансплантата легкого с использованием мышиной модели трансплантации. Основной метод исследования заключается в окрашивании пикросириусом красным для полуколичественной оценки отложения коллагена, что позволяет дифференцировать толстые и тонкие коллагеновые волокна.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Хроническое отторжение аллотрансплантата легкого
- Характеристика фиброзной ткани
- Мышиные модели трансплантации
Теоретическая справка
- Качественная оценка фиброзного ремоделирования широко распространена, однако в данной работе предлагается более количественный подход.
- У аллогенных линий мышей наблюдаются различные степени фиброза трансплантата.
- Гистологический анализ имеет решающее значение для понимания жизнеспособности трансплантата и тканевого ответа.
Используемые методы
- Окрашивание пикросириусом красным для оценки содержания коллагена
- Мышиная модель трансплантации легкого
- Цифровой анализ изображений с использованием специализированного программного обеспечения
Основные результаты
- Повышение общего содержания коллагена в трансплантатах с главным комплексом гистосовместимости, несовместимым по основным антигенам, по сравнению с трансплантатами, несовместимыми по второстепенным антигенам.
- Тонкие коллагеновые волокна чаще встречались в моделях с основным несовпадением по сравнению с контрольной группой.
- Значимых различий в содержании толстых коллагеновых волокон между исследуемыми группами выявлено не было.
Выводы
- Данное исследование демонстрирует эффективность окрашивания пикросириусом красным для оценки фиброзных изменений в трансплантатах легких.
- Полученные результаты имеют значение для понимания механизмов отторжения трансплантата и развития фиброза в биологии трансплантации.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Количественная оценка фиброза является критически важной задачей в доклинических моделях хронического отторжения аллотрансплантата легкого, что напрямую влияет на прогностическую достоверность трансляционных исследований. Окрашивание пикросириусом красным позволяет проводить полуколичественную оценку отложения коллагена, что способствует снижению рисков при изучении механизмов и валидации мишеней в моделях фиброзных заболеваний. Данный подход улучшает процесс принятия решений по портфелю исследований, предоставляя воспроизводимые данные о ремоделировании тканей с пространственным разрешением.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать фибротические пути и количественно оценивать ремоделирование коллагена в соответствующих моделях заболеваний.
- Способствует биологическому снижению рисков за счет разграничения толстых и тонких коллагеновых волокон в аллотрансплантатах.
- Повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней для антифибротических стратегий.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных гистопатологических конечных точек для последующего скрининга соединений на моделях мышей.
- Стандартизация полуколичественного измерения коллагена для обеспечения воспроизводимости результатов в различных исследованиях.
- Обеспечение масштабируемых рабочих процессов цифрового анализа изображений для получения количественных результатов анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит количественную оценку фиброза на доклиническом этапе в соответствие с разработкой трансляционных биомаркеров в исследованиях по трансплантации легких.
- Обеспечивает преемственность от механизмов, изученных на этапе поиска, до доклинической валидации антифиброзных вмешательств.
- Обосновывает решения о переходе к следующим этапам исследований с учетом рисков путем количественной оценки степени ремоделирования тканей.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в континуум «от открытия до доклинических исследований», обеспечивая надежную количественную оценку фиброза в моделях аллотрансплантации легкого у мышей.
- Открытия в биологии: Оказывает поддержку при проверке гипотез о фиброзном ремоделировании и участии сигнальных путей в хроническом отторжении.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые количественные показатели коллагена для разработки методов анализа и оценки соединений.
- Аналитика: Предоставляет результаты цифрового анализа изображений для статистического сравнения экспериментальных групп.
- Трансляционные исследования: Связывает доклинические конечные точки фиброза с потенциальными стратегиями поиска клинических биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: Устанавливает стандартизированный, многократно используемый рабочий процесс оценки фиброза для различных моделей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в исследованиях фиброза.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость гистопатологического анализа.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработок («go/no-go») и повышает эффективность использования капитала за счет обеспечения надежных количественных конечных точек.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию антифибротических кандидатов и моделей с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области гистопатологии и цифрового анализа изображений.
- Необходим доступ к микроскопии, поляризационным фильтрам и программному обеспечению для обработки изображений (например, Fiji).
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов окрашивания и анализа.
- Может потребоваться адаптация для различных типов тканей или моделей животных.
- Потенциальные ограничения включают вариабельность интенсивности окрашивания и пороговой обработки изображений.
