Производство суспензионных культур и очистка аденоассоциированного вируса с помощью градиентного центрифугирования с градиентом плотности йодиксанола для применения in vivo
9 февраля 2024 г.
Аденоассоциированный вирус получают в культуре суспензионных клеток и очищают центрифугированием с двойным градиентом плотности йодиксанола. Включены шаги по увеличению общего выхода вируса, снижению риска выпадения вируса в осадок и дальнейшей концентрации конечного вирусного продукта. Ожидаемые конечные титры достигают10-12 вирусных частиц/мл и пригодны для доклинического применения in vivo .
Мы используем подход направленной эволюции для выявления аденоассоциированных вирусных капитов с более высоким тропизмом для целевых типов клеток человека. Благодаря этому исследованию мы стремимся создать рекомбинантные аденоассоциированные вирусные векторы с улучшенной трансдукцией клеток-мишеней и клинической значимостью в области генной терапии. Наша группа недавно детаргетировала несколько серотипов AAV из печени, включив остатки капсида, исходные для серотипа AAV, который естественным образом обладает сниженным тропизмом печени.
В случае успешного расширения на дополнительные серотипы, это создает основу для снижения необходимой клинической дозы RAAV путем периферической инъекции и уменьшения неблагоприятных исходов для пациентов. Несмотря на то, что метод очистки IODIXanol является экономически эффективным, его трудно масштабировать. Кроме того, в последующих приложениях подход направленной эволюции выполняется на животных моделях или in vitro.
Таким образом, капсид, выделенный направленной эволюцией, может не трансдуцировать мишени in vivo у людей в той же степени, что и в доклинических моделях. Этот протокол является недорогим и доступным для небольших лабораторий. Кроме того, этот метод позволяет получить рекомбинантный аденоассоциированный вирус высокой чистоты, который может быть использован для последующих доклинических применений in vivo.
Обзор
Данное исследование посвящено направленной эволюции капсидов аденоассоциированных вирусов (AAV) для усиления их тропизма к определенным типам клеток человека. Целью работы является разработка рекомбинантных векторов AAV, которые улучшают трансдукцию целевых клеток, что имеет решающее значение для применения в генной терапии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Генная терапия
- Аденоассоциированные вирусы
- Разработка вирусных векторов
Обзор
- Аденоассоциированные вирусы используются в генной терапии благодаря их безопасности и эффективности.
- Улучшение тропизма может привести к более эффективным терапевтическим результатам.
- Современные методы производства и очистки AAV могут быть трудномасштабируемыми.
- Направленная эволюция предлагает стратегию для улучшения свойств вирусных векторов.
Цель исследования
- Для идентификации капсидов AAV с повышенным тропизмом к клеткам человека.
- Для снижения тропизма к печени у определенных серотипов AAV.
- Для потенциального снижения клинической дозы, необходимой для эффективной генной терапии.
Используемые методы
- Метод направленной эволюции для модификации капсида.
- Использование животных моделей и систем in vitro для тестирования.
- Центрифугирование в градиенте плотности иодиксанола для очистки вируса.
- Оценка выхода вирусных частиц и эффективности трансдукции.
Основные результаты
- Идентификация капсидов с улучшенным тропизмом к клеткам-мишеням.
- Успешное снижение сродства серотипов AAV к печени (детargeting).
- Демонстрация повышенной способности к трансдукции на доклинических моделях.
- Разработка масштабируемого метода очистки, несмотря на имеющиеся сложности.
Выводы
- Направленная эволюция может эффективно улучшать свойства капсида AAV.
- Снижение тропности к печени может привести к более безопасному применению генной терапии.
- Необходимы дальнейшие исследования для распространения этих результатов на дополнительные серотипы.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для соответствующей отрасли
Производство в суспензионных культурах и очистка с помощью градиента плотности иодиксанола позволяют получать высокочистый вектор rAAV для доклинических исследований in vivo, что способствует продвижению разработок в области генной терапии. Данный протокол, не зависящий от серотипа, упрощает создание различных капсидов AAV, включая модифицированные для изменения тропизма, и обеспечивает воспроизводимую основу для трансляционной разработки векторов. Доступность метода и стабильность выхода продукта имеют критическое значение для оптимизации векторов на ранних стадиях и отбора перспективных кандидатов из портфеля разработок.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет создавать варианты rAAV для функционального анализа эффективности доставки генов в целевые типы клеток.
- Способствует механистическому снижению рисков путем предоставления векторов для исследований трансдукции в конкретных тканях и сигнальных путях.
- Облегчает быстрое прототипирование и валидацию модифицированных капсидов с измененным тропизмом.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение высокоочищенного концентрированного rAAV, подходящего для количественных скрининговых анализов in vitro и in vivo.
- Стандартизирует количество вводимого вектора для обеспечения воспроизводимости при разработке анализов и сравнении результатов различных исследований.
- Обеспечивает масштабируемость для скрининга множества вариантов капсидов или трансгенных конструкций.
Трансляционные и доклинические исследования
- Обеспечивает векторы для исследований на доклинических моделях животных для оценки адресности доставки в ткани и внецелевых эффектов.
- Поддерживает согласование трансляционных биомаркеров, позволяя проводить валидацию эффективности векторов in vivo.
- Снижает риск появления мешающих белковых загрязнений в последующих исследованиях эффективности и безопасности.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол служит связующим звеном между этапом первичного поиска и доклинической валидацией, обеспечивая получение высококачественного rAAV как для изучения механизмов действия, так и для трансляционных исследований. Он представляет собой базовую технологию для инженерного проектирования векторов, скрининга и рабочих процессов по подтверждению концепции in vivo.
- Поисковая биология: предоставляет векторы для проверки гипотез об модификациях капсида и тканевом таргетинге.
- Скрининг: обеспечивает стандартизированный rAAV с высоким титром для надежной разработки анализа и сравнительного анализа.
- Аналитика: позволяет количественно измерять выход и чистоту вирусных частиц для оптимизации процесса.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность от скрининга in vitro до валидации in vivo на моделях животных.
- Корпоративное повторное использование: предлагает широко применимый, независимый от серотипа рабочий процесс для различных программ генной терапии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую уверенность в эффективности вектора и валидации мишени.
- Операционная ценность: обеспечивает воспроизводимое, масштабируемое и экономически эффективное производство rAAV для научно-исследовательских групп.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении работы с кандидатами в векторы и снижает биологические риски на поздних этапах.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию модифицированных капсидов и трансгенных конструкций с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами клеток в суспензии, методами трансфекции и ультрацентрифугирования.
- Необходим доступ к ультрацентрифугам, перистальтическим насосам и аналитическим инструментам для оценки титра и чистоты.
- Стандартизация между группами исследователей имеет важное значение для воспроизводимости и сопоставимости результатов различных исследований.
- Возможность адаптации для крупномасштабного производства ограничена масштабируемостью центрифугирования в градиенте иодиксанола.
- Протокол оптимизирован для получения векторов в исследовательских масштабах, а не для производства препаратов клинического качества.
