Выделение аденоассоциированных вирусных векторов с помощью одноэтапного и полуавтоматического протокола гепариновой аффинной хроматографии

В данной рукописи описан подробный протокол генерации и очистки аденоассоциированных вирусных векторов с использованием оптимизированного метода аффинной хроматографии на основе гепарина. Он представляет собой простой, масштабируемый и экономичный подход, устраняющий необходимость в ультрацентрифугировании. Полученные векторы проявляют высокую чистоту и биологическую активность, доказывая свою ценность в доклинических исследованиях.

В этой работе мы намерены разработать усовершенствованный протокол производства, очистки и характеристики мозаичных аденоассоциированных вирусных векторов, который мог бы доказать свою ценность в доклинических исследованиях. Несмотря на усилия по созданию стабильных клеточных линий-продуцентов, транзиторная трансфекция в клетках млекопитающих по-прежнему является преобладающим рабочим процессом для производства AAV. Затем AAV очищаются центрифугированием со сверхвысокой скоростью градиента плотности или методами хроматографии, которые полагаются на биохимические свойства вирусных частиц.

Обычно используемые методы очистки AAV используют хлорид цезия или ультрацентрифугирование с градиентом плотности йодиксанола. Несмотря на свои преимущества, они имеют некоторые ограничения. Они отнимают много времени, имеют ограниченную масштабируемость и часто дают результаты для некоторых векторов с низкой чистотой.

Теперь, чтобы преодолеть эти ограничения, несколько исследователей обратили свое внимание на методы хроматографии. Мы описываем пошаговый протокол генерации мозаичных rAAV, основанный на гепарин-связывающей способности AAV2. Этот метод делает высокочистые и биологически активные rAAV готовыми к использованию в течение шести дней, представляя собой полуавтоматическую, масштабируемую и экономически эффективную стратегию для создания rAAV для доклинических исследований.

Продемонстрировав применимость этого метода для получения мозаичных rAAV, производственная система теперь может быть точно настроена для достижения лучшей масштабируемости и экономической эффективности путем создания производственной клеточной линии. Кроме того, мы стремимся удалить пустые частицы, включив вторую стадию полировальной очистки.