Подготовка образцов органоидов сетчатки для просвечивающей электронной микроскопии
7 июня 2024 г.
Этот протокол обеспечивает оптимизированную и сложную процедуру подготовки образцов органоидов сетчатки для просвечивающей электронной микроскопии. Он подходит для приложений, связанных с анализом синапсов в зрелых органоидах сетчатки.
Наши исследования в первую очередь сосредоточены на анализе синаптической ультраструктуры в зрелых органоидах сетчатки. Мы стремимся разработать воспроизводимый и простой метод подготовки образцов органоидов сетчатки с помощью просвечивающего электронного микроскопа, или ПЭМ, который может принести большую пользу в области исследований органоидов сетчатки. По сравнению с другими методами, такими как оптический микроскоп, просвечивающий электронный микроскоп дает возможность охарактеризовать ультраструктуру интегрального синапса и субклеточных органелл в органоидах сетчатки на наноуровне.
Наш протокол предлагает оптимизированные условия для подготовки образцов органоидов сетчатки с помощью просвечивающего электронного микроскопа, возвращая простую и удобную для пользователя статистику. Наши результаты ясно показывают ультраструктурную морфологию синапса в органоидах сетчатки, включая как обычный синапс, так и ленточный синапс. Таким образом, закладывается прочная основа и представляются воспроизводимые методы для последующих функциональных исследований органоидов сетчатки, а также для оценки их клинического применения, такого как скрининг лекарственных препаратов.
Обзор
В данном протоколе представлена оптимизированная процедура подготовки образцов ретинальных органоидов для трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ). Исследование сосредоточено на анализе синаптической автоструктуры в зрелых ретинальных органоидах, предлагая доступный метод, который позволяет проводить детальный субклеточный анализ на наноразмерном уровне.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология сетчатки
- Электронная микроскопия
Теоретические основы
- Ретинальные органоиды служат ценными моделями для изучения структур и функций сетчатки.
- Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) позволяет получать изображения клеточных компонентов с высоким разрешением.
- Целью данного исследования является совершенствование методов подготовки проб для ПЭМ для проведения детального анализа.
- Зрелые ретинальные органоиды обладают синаптическими структурами, которые могут быть охарактеризованы с помощью этого метода.
Цель исследования
- Разработать воспроизводимый и простой метод подготовки образцов ретинальных органоидов для ПЭМ.
- Оценить ультраструктурную морфологию синапсов в этих органоидах.
- Создать основу для функциональных исследований и клинического применения.
Используемые методы
- Использование ретинальных органоидов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК).
- Протокол включает процессы фиксации, окрашивания, обезвоживания и заливки, адаптированные для ПЭМ.
- Ключевые этапы включают окрашивание осмием, градиентное обезвоживание и заливку в эпоксидную смолу.
- Наблюдения проводятся с использованием полутонкого микротома и оптической микроскопии после завершения подготовки.
Основные результаты
- Данный метод позволяет успешно визуализировать как обычные, так и ленточные синапсы в ретинальных органоидах.
- Ультраструктурная морфология четко определена, что создает надежную основу для дальнейших исследований.
- Полученные результаты подтверждают воспроизводимость метода, что позволяет проводить последующие функциональные исследования.
Выводы
- Данное исследование позволяет провести детальный анализ синаптических структур в ретинальных органоидах с помощью ПЭМ.
- Оптимизированный метод подготовки образцов способствует проведению дальнейших исследований функциональных свойств ретинальных органоидов.
- Результаты имеют значение для понимания нейронных механизмов и потенциального клинического применения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Ультраструктурный анализ ретинальных органоидов с высоким разрешением позволяет снизить механистические риски и подтвердить валидность мишеней на ранних этапах разработки офтальмологических препаратов. Протоколы подготовки образцов ретинальных органоидов для просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) обеспечивают воспроизводимые количественные данные об архитектуре синапсов, что повышает прогностическую уверенность в системах, релевантных конкретным заболеваниям. Эта возможность укрепляет трансляционную преемственность от фундаментальных биологических исследований к оценке доклинических моделей в портфелях исследований сетчатки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Обеспечивает прямую визуализацию ультраструктуры синапсов для валидации функциональных мишеней.
- Способствует снижению механистических рисков за счет разграничения ленточных и обычных синапсов в моделях органоидов.
- Предоставляет количественные морфологические показатели для проверки гипотез в биологии сетчатки.
Скрининг и разработка анализа
- Устанавливает валидированные рабочие процессы подготовки образцов для обеспечения согласованности последующих анализов с применением визуализации.
- Способствует воспроизводимой оценке созревания органоидов и целостности синапсов.
- Обеспечивает стандартизацию обработки образцов для масштабируемого скрининга фенотипов сетчатки.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит ультраструктуру органоидов в соответствие с патологическими особенностями сетчатки человека для разработки трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает преемственность между этапами открытий in vitro и доклинической валидации, предоставляя надежные морфологические конечные точки.
- Снижает биологическую неопределенность при выборе моделей для разработки офтальмологических препаратов.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный протокол подготовки образцов для ПЭМ интегрируется в континуум от открытия до доклинических исследований, обеспечивая достоверный морфологический анализ ретинальных органоидов, полученных из иПСК.
- Открытия в биологии: предоставляет прямые доказательства формирования и созревания синаптических контактов в органоидных системах.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты визуализации для сравнительного анализа в различных условиях.
- Аналитика: поддерживает статистическую оценку морфологии и плотности синапсов в экспериментальных когортах.
- Трансляционные исследования: связывает результаты in vitro с доклиническими конечными точками посредством ультраструктурного сопоставления.
- Корпоративное повторное использование: предлагает стандартизированный, повторяемый протокол, адаптируемый для различных платформ ретинальных органоидов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность моделирования заболеваний сетчатки и валидации мишеней.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и стандартизацию рабочих процессов ультраструктурной визуализации.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) за счет снижения механистической неопределенности на ранних этапах поиска.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию мишеней и моделей сетчатки для дальнейшего продвижения с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в подготовке образцов для ПЭМ и анализе субклеточных изображений.
- Необходим доступ к специализированному оборудованию для фиксации, заливки и микроскопии.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов обработки образцов и визуализации.
- Метод может быть адаптирован для различных систем органоидов, производных от иПСК, при условии оптимизации протокола.
- Воспроизводимость результатов зависит от контроля качества реагентов и материалов для заливки.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:38
Retinal Organoid Fixation and Post Fixation Procedure for TEM Sample Preparation
2:39
Staining, Dewatering, and Infiltration of Fixed Retinal Organoids for TEM Sample Preparation
4:24
Retinal Organoid Embedding and Semi‐Thin Slice Positioning for Transmission Electron Microscopy
