Подготовка образцов органоидов сетчатки для просвечивающей электронной микроскопии
June 7th, 2024
Этот протокол обеспечивает оптимизированную и сложную процедуру подготовки образцов органоидов сетчатки для просвечивающей электронной микроскопии. Он подходит для приложений, связанных с анализом синапсов в зрелых органоидах сетчатки.
Наши исследования в первую очередь сосредоточены на анализе синаптической ультраструктуры в зрелых органоидах сетчатки. Мы стремимся разработать воспроизводимый и простой метод подготовки образцов органоидов сетчатки с помощью просвечивающего электронного микроскопа, или ПЭМ, который может принести большую пользу в области исследований органоидов сетчатки. По сравнению с другими методами, такими как оптический микроскоп, просвечивающий электронный микроскоп дает возможность охарактеризовать ультраструктуру интегрального синапса и субклеточных органелл в органоидах сетчатки на наноуровне.
Наш протокол предлагает оптимизированные условия для подготовки образцов органоидов сетчатки с помощью просвечивающего электронного микроскопа, возвращая простую и удобную для пользователя статистику. Наши результаты ясно показывают ультраструктурную морфологию синапса в органоидах сетчатки, включая как обычный синапс, так и ленточный синапс. Таким образом, закладывается прочная основа и представляются воспроизводимые методы для последующих функциональных исследований органоидов сетчатки, а также для оценки их клинического применения, такого как скрининг лекарственных препаратов.
Обзор
Этот протокол предоставляет оптимизированную процедуру для подготовки образцов ретинальных органоидов для электронной микроскопии (ЭМ). Исследование направлено на анализ синаптической автоструктуры в зрелых ретинальных органоидах, предоставляя удобный метод, который позволяет детальный субклеточный анализ на наноуровне.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология сетчатки
- Электронная микроскопия
Предыстория
- Ретинальные органоиды служат ценными моделями для исследования структур и функций сетчатки.
- Электронная микроскопия позволяет проводить высокоразрешающее исследование клеточных компонентов.
- Цель исследования — улучшить методы подготовки образцов для ЭМ для детального анализа.
- Зрелые ретинальные органоиды демонстрируют синаптические структуры, которые можно характеризовать этим методом.
Цель исследования
- Разработать воспроизводимый и простой метод подготовки образцов для ЭМ ретинальных органоидов.
- Оценить ультраструктурную морфологию синапсов в этих органоидах.
- Заложить основу для функциональных исследований и клинических приложений.
Использованные методы
- Использование ретинальных органоидов, полученных из индукированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК).
- Протокол включает процессы фиксации, окрашивания, дегидратации и вложения, адаптированные для ЭМ.
- Ключевые шаги включают окрашивание осмием, градиентную дегидратацию и вложение в эпоксидную смолу.
- Наблюдения проводятся с помощью полутонкого микротома и оптической микроскопии после подготовки.
Основные результаты
- Метод успешно выявляет как обычные, так и ленточные синапсы в ретинальных органоидах.
- Ультраструктурные морфологии четко определены, создавая надежный фундамент для дальнейших исследований.
- Результаты подтверждают воспроизводимость метода, позволяя последующие функциональные исследования.
Выводы
- Это исследование позволяет проводить детальный анализ синаптических структур в ретинальных органоидах с помощью ЭМ.
- Оптимизированный метод подготовки способствует будущим исследованиям в области функциональных исследований ретинальных органоидов.
- Последствия распространяются на понимание нейронных механизмов и потенциальных клинических приложений.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
High-resolution ultrastructural analysis of retinal organoids enables mechanistic de-risking and target validation in early ophthalmic drug discovery. Transmission electron microscopy (TEM) sample preparation protocols for retinal organoids provide reproducible, quantitative insights into synaptic architecture, supporting predictive confidence in disease-relevant systems. This capability strengthens translational continuity from discovery biology to preclinical model evaluation in retinal research portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of synaptic ultrastructure for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing ribbon and conventional synapses in organoid models.
- Provides quantitative morphological benchmarks for hypothesis testing in retinal biology.
Screening & Assay Development
- Establishes validated sample preparation workflows for consistent downstream imaging assays.
- Facilitates reproducible assessment of organoid maturation and synaptic integrity.
- Enables standardization of sample handling for scalable screening of retinal phenotypes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns organoid ultrastructure with disease-relevant human retinal features for translational biomarker development.
- Supports continuity from in vitro discovery to preclinical validation by providing robust morphological endpoints.
- Reduces biological ambiguity in model selection for ophthalmic drug development.
Pipeline & Workflow Integration
This TEM sample preparation protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-confidence morphological analysis of retinal organoids derived from iPSCs.
- Discovery Biology: Provides direct evidence for synaptic contact formation and maturation in organoid systems.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for comparative analysis across conditions.
- Analytics: Supports statistical evaluation of synaptic morphology and density in experimental cohorts.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with preclinical endpoints through ultrastructural alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, repeatable protocol adaptable across retinal organoid platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in retinal disease modeling and target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of ultrastructural imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by reducing mechanistic uncertainty in early discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of retinal targets and models for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in TEM sample preparation and subcellular imaging analysis.
- Demands access to specialized fixation, embedding, and microscopy instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling and imaging protocols.
- Adaptable to various iPSC-derived organoid systems with protocol optimization.
- Dependent on quality control of reagents and embedding materials for reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:38
Retinal Organoid Fixation and Post Fixation Procedure for TEM Sample Preparation
2:39
Staining, Dewatering, and Infiltration of Fixed Retinal Organoids for TEM Sample Preparation
4:24
Retinal Organoid Embedding and Semi‐Thin Slice Positioning for Transmission Electron Microscopy
