Оценка разрушения гематоэнцефалического барьера на мышиной модели легкой черепно-мозговой травмы

Мы стремимся понять сложные механизмы, лежащие в основе легкой черепно-мозговой травмы, вызванной воздействием ударных волн, вызванных взрывом. Мы также изучаем методы облегчения этих симптомов. В нем всесторонне описана начальная фаза разрушения гематоэнцефалического барьера из-за ударных волн низкой интенсивности, вызванных взрывом.

В частности, разрушение начинается внезапно, примерно через три часа после воздействия, и пораженные поражения подвергаются ремоделированию в течение примерно одного дня после начала заболевания. Этот метод позволяет нам более подробно изучить разбивку ГЭБ, предоставляя дополнительную метрику для оценки эффективности различных методов лечения, которые могут быть использованы в случае взрыва. Для начала подготовьте электрошоковую трубку для воздействия на животное ударных волн, вызванных взрывом.

Расположите мышь под наркозом на расстоянии пяти сантиметров от выходного конца ударной трубки, следя за тем, чтобы ось ее тела была параллельна, но не выровнена по оси трубки. Затем подайте в голову животного одиночную взрывную ударную волну с пиковым избыточным давлением в 25 килопаскалей. Для инъекции синего Эванса приготовьте 4%-ный массовый раствор синего Эванса в физрастворе.

Сделайте раствор вихревым и храните его в темноте до использования. Введите раствор синего Эванса в хвостовую вену в дозировке 2,5 микролитра на грамм. После перфузии мыши, находящейся под наркозом, красителем FITC-декстрана и параформальдегидом с помощью хирургических ножниц и пинцета осторожно удалите мозг.

Постфиксируйте мозг на ночь в тот же фиксатор при четырех градусах Цельсия. На следующий день замените фиксатор на PBS. Для начала получите фиксированный мозг от мыши, обработанной взрывной волной, которой ввели синий Эванса и красители FITC-декстрана.

Приготовьте 24-луночный планшет с 500 микролитрами 20% глицерина в фосфатном буфере, отрегулированном до pH 7,4 в каждой лунке. С помощью мозгового среза разрежьте мозг коронально на 12 срезов, каждый толщиной в один миллиметр. Переложите каждый ломтик в соответствующую лунку 24-луночного планшета и храните планшет при температуре четыре градуса Цельсия не менее двух часов.

Затем замените раствор 50% фосфатным буфером глицерина и снова храните его при температуре четыре градуса Цельсия не менее двух часов. Наконец, замените раствор на 100% глицерин. Для немедленного микроскопического наблюдения дайте срезам постоять не менее двух часов при комнатной температуре.

Добавьте 500 микролитров глицерина на дно 35-миллиметровой посуды со стеклянным дном. Перенесите срез мозга в раствор глицерина и накройте поверхность покровным стеклом. Удалите излишки глицерина с края покровного стекла.

Измерьте интенсивность флуоресценции среза под флуоресцентным микроскопом. После микроскопического измерения верните ломтик в лунку планшета. Добавьте 500 микролитров фосфатного буфера в каждую лунку и храните 24-луночный планшет при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи.

Замените раствор буфером из 30% глицеринфосфата и инкубируйте планшет при температуре 4 градуса Цельсия в течение не менее двух часов перед проведением иммуногистохимии Синяя маркировка показала, что разрушение гематоэнцефалического барьера или ГЭБ началось в течение шести часов после воздействия взрывной волны и продолжалось до семи дней. Флуоресцентные горячие точки различались по размеру и интенсивности, при этом синие горячие точки Эванса указывали на разрушение ГЭБ во время синей инжекции Эванса и восстановление после инжекции FITC-декстрана. Кластеры реакционноспособных астроцитов были тесно связаны с местами распада ГЭБ, подтвержденными иммуногистохимическими данными.

Активированная микроглия и амебоидная микроглия наблюдались наряду с реактивными астроцитами через три дня после воздействия взрывной ударной волны.