Выделение, экспансия и дифференцировка фиброадипогенных предшественников из модели колючей мыши
15 ноября 2024 г.
Этот протокол описывает выделение фиброадипогенных предшественников (FAP) скелета и сердечной мышцы от колючей мыши (Acomys) с помощью ферментативной диссоциации и сортировки клеток, активируемых флуоресценцией. FAP, полученные по этому протоколу, могут быть эффективно расширены и дифференцированы до миофибробластов и адипоцитов.
Наше всеобъемлющее видение заключается в том, чтобы лучше понять и усвоить клеточную коммуникацию и поведение клеток, приводящее к метастазированию в ткани, а также то, как клеточные процессы неправильно регулируются при восстановлении питания. Для этого мы используем различные модели, одной из которых является мышь Spiny. Одной из основных проблем с этой новой моделью мыши является нехватка инструментов для ее изучения.
Здесь мы предоставляем новый протокол, который содержит надежное расщепление ферментов и окрашивание антителами. Это позволяет успешно сортировать фиброадипогенные предшественники и культивировать их in vitro для дальнейшего анализа их судьбы. Мы протестировали различные комбинации и концентрации ферментов, а также множественные антитела, и наш метод дает рекомендации для наиболее надежного и надежного протокола.
Поскольку теперь у нас есть надежное ферментативное расщепление, мы продолжим тестирование других маркеров и антител для успешного анализа эндотелиальных клеток, перицитов, иммунных клеток и миогенных клеток.
Обзор
В данном протоколе описывается выделение фибро-адипогенных предшественников (FAPs) скелетных мышц и сердечной мышцы у колючих мышей (Acomys) с использованием ферментативной диссоциации и сортинга клеток с помощью флуоресцентно-активированной сортировки. Данный метод обеспечивает надежное ферментативное переваривание и окрашивание антителами для эффективного сортинга и культивирования FAPs in vitro.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология клетки
- Регенеративная медицина
- Исследования стволовых клеток
Теоретические сведения
- Понимание механизмов клеточной коммуникации и поведения имеет решающее значение для гомеостаза тканей.
- Фибро-адипогенные предшественники играют значительную роль в регенерации тканей.
- Модель ежистой мыши создает определенные трудности в связи с ограниченным количеством исследовательских инструментов.
- Для изучения FAPs на данной модели необходимы надежные протоколы.
Цель исследования
- Разработать надежный протокол выделения FAP из тканей колючих мышей.
- Обеспечить возможность дальнейшего анализа дифференцировки FAP в миофибробласты и адипоциты.
- Создать основу для изучения других типов клеток на модели колючей мыши.
Используемые методы
- Ферментативная диссоциация мышечной ткани.
- Сортировка клеток с помощью флуоресцентно-активированного клеточного сортера (FACS) для выделения FAP.
- Тестирование различных комбинаций и концентраций ферментов.
- Использование нескольких антител для эффективной сортировки.
Основные результаты
- Успешное выделение и экспансия FAPs из колючих мышей.
- FAPs могут дифференцироваться в миофибробласты и адипоциты.
- Разработка надежного протокола ферментативного переваривания.
- Предоставлены рекомендации по методам надежного окрашивания антителами.
Выводы
- Разработанный протокол расширяет возможности изучения FAPs у колючих мышей.
- В будущих исследованиях могут быть изучены дополнительные маркеры и типы клеток.
- Данная работа вносит вклад в понимание механизмов восстановления тканей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Оптимизированное выделение и экспансия фибро-адипогенных предшественников (FAPs) из модели колючей мыши устраняют критический пробел в исследованиях в области регенеративной медицины, обеспечивая возможность детального изучения механизмов восстановления тканей. Данная методика способствует ранним этапам поиска новых терапевтических мишеней, сосредоточенных на межклеточной коммуникации, ремоделировании внеклеточного матрикса и сравнительной регенеративной биологии. Протокол повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней и снижает механистические риски при разработке доклинических моделей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать регенеративные пути и межклеточное взаимодействие на высокорегенеративной модели млекопитающих.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем выделения и экспансии FAPs для последующих механистических исследований.
- Способствует биологическому снижению рисков, предоставляя платформу для сравнения регенеративных ответов колючей мыши и Mus musculus.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение валидированных популяций клеток для стандартизированных анализов дифференцировки и ремоделирования матрикса in vitro.
- Повышает воспроизводимость анализов за счет надежных протоколов ферментативного переваривания и сортинга клеток с использованием антител.
- Позволяет проводить количественную оценку путей дифференцировки FAP при заданных условиях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует системам, имеющим значение для изучения заболеваний, за счет моделирования восстановления тканей и фиброза в контексте млекопитающих.
- Способствует поиску трансляционных биомаркеров, обеспечивая возможность проведения сравнительных исследований механизмов регенерации.
- Обосновывает решения по продвижению портфелей регенеративной медицины с учетом оценки рисков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол интегрируется в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, предоставляя надежный метод выделения и экспансии FAP для механистических, скрининговых и трансляционных исследований.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез о судьбе клеток и ремоделировании матрикса в контексте регенерации.
- Скрининг: обеспечивает получение воспроизводимых, хорошо охарактеризованных популяций клеток для разработки анализов и оценки соединений.
- Аналитика: позволяет количественно измерять результаты дифференцировки и чистоту клеточных популяций.
- Трансляционные исследования: облегчает межвидовое сравнение регенеративных процессов и согласование биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает воспроизводимый протокол для выделения дополнительных типов клеток из модели колючей мыши.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации регенеративных мишеней и проведении механистических исследований.
- Операционная ценность: Стандартизирует рабочие процессы выделения и экспансии клеток для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшего продолжения разработок (go/no-go) за счет снижения биологической неопределенности на ранних этапах исследований.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию программ регенеративной медицины с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с проточной цитометрией, ферментативной диссоциацией тканей и культивированием клеток.
- Необходим доступ к оборудованию для FACS и валидированным панелям антител.
- Для обеспечения воспроизводимости требуется межкомандная стандартизация протоколов дигестии и окрашивания.
- По мере расширения исследований может потребоваться адаптация метода для других типов тканей или видов.
- Метод зависит от текущей оптимизации для выявления дополнительных клеточных маркеров и популяций.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:13
Collection of Skeletal and Cardiac Muscles from Spiny Mouse for Isolating Fibro‐Adipogenic Progenitors (FAPs)
2:46
Digestion of Mouse Skeletal and Cardiac Muscles for Fluorescence‐Activated Cell Sorting and Culture of Fibro‐Adipogenic Progenitors (FAPs)
5:01
Fluorescence‐Activated Cell Sorting and Culture of Fibro‐Adipogenic Progenitors (FAPs)
