Выделение, экспансия и дифференцировка фиброадипогенных предшественников из модели колючей мыши
15 ноября 2024 г.
Этот протокол описывает выделение фиброадипогенных предшественников (FAP) скелета и сердечной мышцы от колючей мыши (Acomys) с помощью ферментативной диссоциации и сортировки клеток, активируемых флуоресценцией. FAP, полученные по этому протоколу, могут быть эффективно расширены и дифференцированы до миофибробластов и адипоцитов.
Наше всеобъемлющее видение заключается в том, чтобы лучше понять и усвоить клеточную коммуникацию и поведение клеток, приводящее к метастазированию в ткани, а также то, как клеточные процессы неправильно регулируются при восстановлении питания. Для этого мы используем различные модели, одной из которых является мышь Spiny. Одной из основных проблем с этой новой моделью мыши является нехватка инструментов для ее изучения.
Здесь мы предоставляем новый протокол, который содержит надежное расщепление ферментов и окрашивание антителами. Это позволяет успешно сортировать фиброадипогенные предшественники и культивировать их in vitro для дальнейшего анализа их судьбы. Мы протестировали различные комбинации и концентрации ферментов, а также множественные антитела, и наш метод дает рекомендации для наиболее надежного и надежного протокола.
Поскольку теперь у нас есть надежное ферментативное расщепление, мы продолжим тестирование других маркеров и антител для успешного анализа эндотелиальных клеток, перицитов, иммунных клеток и миогенных клеток.
Обзор
В данном протоколе описан метод выделения фибро-адипогенных предшественников (FAPs) скелетных мышц и мышц сердца иглянистых мышей (Acomys) с использованием ферментативной диссоциации и сортинга клеток с помощью флуоресцентно-активированной сортировки. Описываемый метод обеспечивает надежное расщепление ферментами и окрашивание антителами для эффективного сортинга и последуго культивирования FAPs in vitro.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Регенеративная медицина
- Исследования стволовых клеток
Теоретические сведения
- Понимание клеточной коммуникации и поведения имеет решающее значение для гомеостаза тканей.
- Фибро-адипогенные предшественники играют значительную роль в регенерации тканей.
- Модель ежиного мышонка представляет определенные трудности из-за ограниченного количества исследовательских инструментов.
- Для изучения FAP в данной модели необходимы надежные протоколы.
Цель исследования
- Разработать надежный протокол выделения FAP из тканей ежиных мышей.
- Обеспечить возможность дальнейшего анализа дифференцировки FAP в миофибробласты и адипоциты.
- Создать основу для изучения других типов клеток на модели ежиной мыши.
Используемые методы
- Ферментативная диссоциация мышечной ткани.
- Сортировка клеток с помощью флуоресцентно-активированного клеточного сортера (FACS) для выделения FAP.
- Тестирование различных комбинаций и концентраций ферментов.
- Использование нескольких антител для эффективной сортировки.
Основные результаты
- Успешное выделение и экспансия FAPs из тканей колючих мышей.
- FAPs могут дифференцироваться в миофибробласты и адипоциты.
- Разработка надежного протокола ферментативного переваривания.
- Предоставлены рекомендации по эффективным методам окрашивания антителами.
Выводы
- Разработанный протокол расширяет возможности изучения FAPs у колючих мышей.
- В последующих исследованиях можно изучить дополнительные маркеры и типы клеток.
- Данная работа вносит вклад в понимание механизмов восстановления тканей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Оптимизированная изоляция и экспансия фибро-адипогенных предшественников (FAPs) на модели ежиного мышонка устраняют критический пробел в исследованиях в области регенеративной медицины, позволяя детально изучать механизмы восстановления тканей. Эта возможность способствует ранним этапам поиска решений, сосредоточенным на клеточной коммуникации, ремоделировании внеклеточного матрикса и сравнительной регенеративной биологии. Данный протокол повышает прогностическую уверенность при валидации мишеней и снижении механистических рисков при разработке доклинических моделей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет исследовать регенеративные пути и межклеточную коммуникацию на высокорегенеративной модели млекопитающих.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем выделения и экспансии FAPs для последующих механистических исследований.
- Способствует снижению биологических рисков, предоставляя платформу для сравнения регенеративных ответов колючей мыши и Mus musculus.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение валидированных популяций клеток для стандартизированных анализов дифференцировки и ремоделирования матрикса in vitro.
- Повышает воспроизводимость анализа за счет использования надежных протоколов ферментативного переваривания и сортировки клеток с помощью антител.
- Позволяет проводить количественную оценку путей развития FAP в определенных условиях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует системам, имеющим отношение к заболеваниям, за счет моделирования восстановления тканей и фиброза в контексте млекопитающих.
- Поддерживает поиск трансляционных биомаркеров, позволяя проводить сравнительные исследования механизмов регенерации.
- Обосновывает решения по развитию портфелей регенеративной медицины с учетом скорректированных рисков.
Интеграция в конвейеры и рабочие процессы
Данный протокол интегрируется в континуум от фундаментальных открытий до доклинических исследований, предоставляя надежный метод выделения и экспансии FAPs для механистических, скрининговых и трансляционных исследований.
- Фундаментальная биология: расширяет возможности проверки гипотез о судьбе клеток и ремоделировании матрикса в контекстах регенерации.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые, хорошо охарактеризованные популяции клеток для разработки анализов и оценки соединений.
- Аналитика: позволяет проводить количественное измерение результатов дифференцировки и чистоты клеточных популяций.
- Трансляционные исследования: способствует межвидовому сравнению регенераторных процессов и согласованию биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает воспроизводимый протокол для выделения дополнительных типов клеток из модели колючей мыши.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает прогностическую уверенность при валидации регенеративных мишеней и проведении механистических исследований.
- Операционная ценность: стандартизирует рабочие процессы выделения и экспансии клеток для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о целесообразности дальнейшего развития (go/no-go) за счет снижения биологической неопределенности на ранних этапах исследований.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию программ регенеративной медицины с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области проточной цитометрии, ферментативной диссоциации тканей и культивирования клеток.
- Необходим доступ к оборудованию для FACS и валидированным панелям антител.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов переваривания и окрашивания для обеспечения воспроизводимости.
- По мере расширения исследований может потребоваться адаптация метода для других типов тканей или видов.
- Результаты зависят от постоянной оптимизации для выявления дополнительных клеточных маркеров и популяций.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:13
Collection of Skeletal and Cardiac Muscles from Spiny Mouse for Isolating Fibro‐Adipogenic Progenitors (FAPs)
2:46
Digestion of Mouse Skeletal and Cardiac Muscles for Fluorescence‐Activated Cell Sorting and Culture of Fibro‐Adipogenic Progenitors (FAPs)
5:01
Fluorescence‐Activated Cell Sorting and Culture of Fibro‐Adipogenic Progenitors (FAPs)
