Подготовка мышей к модели тяжелого острого панкреатита с помощью комбинации церулеина и липополисахарида внутрибрюшинной инъекции

Лечение тяжелого острого панкреатита затруднено из-за высоких показателей смертности на животных моделях, в частности на мышах с выбранным фоном C57BL/6J. Мы исследуем SAP как патологический для определения терапевтических мишеней и разработки новых методов лечения, предоставляя метод полимиса в одном исследовании SAP.

Это исследование выявило высокую экспрессию генов HMGB1 при поврежденном панкреатите, что предполагает его связь с воспалительным камнем тяжелого острого панкреатита. Наш протокол включает в себя церулеин, который вызывает сокращение желчного пузыря и нарушает голодание у мышей, что приводит к повреждению тканей поджелудочной железы из-за блокировки секреции пищеварительной жидкости. В сочетании с инъекцией ЛПС мы индуцировали тяжелый панкреатит с органной недостаточностью у мышей. Этот подход является неинвазивным и простым в реализации, благодаря коротким циклам и высокой повторяемости.

[Демонстратор] Для начала измерьте и запишите вес экспериментальной мыши. Для внутрибрюшинного введения церулеина возьмите и удерживайте мышь животом вверх и головой ниже хвоста. Держите шприц в правой руке и введите иглу в подкожную кожу с левой стороны от белой линии живота. Переместите иглу вперед примерно на три-пять миллиметров и введите ее в брюшную полость под углом 45 градусов. Держите иглу неподвижно и медленно вводите церулен. Вытащите иглу, затем аккуратно помассируйте и прижмите место инъекции стерильным ватным тампоном для полного распыления препарата в брюшную полость. Через 12 часов после инъекции поместите мышь в центр сетки в экспериментальную коробку лицом в сторону от экспериментатора. Включите программное обеспечение для отслеживания видео и настройте мониторинг для четырех одновременных полей зрения. Отметьте длину и ширину экспериментального объекта, который может перемещаться внутри коробки на экране мониторинга в реальном времени. Записывайте активность мыши в течение 15 минут. Макроскопические изменения, измеренные на модели мышей с повреждением поджелудочной железы в течение пяти циклов, показали, что мыши в группе 5 с повреждением поджелудочной железы сохраняли низкий уровень дистанции движения в течение трех минут, в то время как коэффициент неподвижности в течение трех минут увеличивался с каждым последующим циклом. Группа 5 с повреждением поджелудочной железы показала наименьшее общее расстояние движения по сравнению с другими экспериментальными группами, и разница была статистически значимой. За исключением контрольной группы и группы 1 по травме поджелудочной железы, во всех группах наблюдался отрицательный рост массы тела по D-значению, при этом группа 5 по травме поджелудочной железы показала наибольшие изменения. Анализ выживаемости показал 80% смертность в группе 5 с повреждением поджелудочной железы к пятому дню, в отличие от других групп, которые не показали существенных различий с контрольной группой. После 36 часов внутрибрюшинного введения церулеина усыпьте и закрепите мышь в лежачем положении на поролоновой пластине. Сделайте срединный разрез брюшной полости и переверните трубку тонкой кишки вправо, чтобы обнажить поджелудочную железу. Отсоедините двенадцатиперстную кишку и пилорический проток. Найдите тонкую кишку под поджелудочной железой, затем полностью освободите ткань поджелудочной железы вдоль кишечного протока. С помощью беззубых щипцов зажмите селезенку и аккуратно потяните вверх. Резко рассекайте ткань задней связки поджелудочной железы вплоть до головки поджелудочной железы. Затем отсоедините желчный проток и кровеносные сосуды. Удалите ткань поджелудочной железы из брюшной полости и промокните поверхностную влагу впитывающей бумагой. Измерьте и запишите вес ткани поджелудочной железы. После подготовки парафиновых срезов дважды очистите ткани поджелудочной железы от воска в ксилоле по пять минут каждая. Обработайте каждый участок 100 микролитрами протеиназы К и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут. Добавьте в ткань необходимое количество 3% перекиси водорода и инкубируйте в течение 20 минут до полного проникновения в нее. Покройте всю площадь образца 50 микролитрами уравновешивающего буфера и инкубируйте в течение 10 минут. Затем добавьте 56 микролитров инкубационного буфера TDT в каждый образец ткани и инкубируйте в течение одного часа. Срезы ткани четыре раза промыть PBS в течение пяти минут каждый перед инкубацией в течение 30 минут в 100 микролитрах реакционного раствора стрептавидин-HRP. Для окрашивания DAB добавьте по 50 микролитров DAB на каждый участок ткани. Погрузите срезы в раствор для окрашивания гематоксилина на три-пять минут перед промыванием чистой водой. Обезвожьте образцы четырьмя раундами свежего безводного этанола в течение пяти минут каждый. Провести гистологическое исследование под микроскопом белого света. Окрашивание TUNEL на тканях поджелудочной железы мышей выявило увеличение клеточного некроза в группе 5 повреждения поджелудочной железы, со значительно более высокими значениями шкалы Серого и положительными показателями некроза по сравнению с другими группами. Белковый иммуноблоттинг оценивал экспрессию каспазы-3, маркера клеточного некроза, и показал значительное увеличение количества тканей в 5-й группе повреждения поджелудочной железы. Проточная цитометрия суспензий ацинарных клеток поджелудочной железы, меченных Nexin 5 fit CPI, показала заметно более высокую смертность клеток в группе 5 повреждения поджелудочной железы по сравнению с другими, со статистической значимостью.