Выделение ядер из межмышечной жировой ткани человека и последующее секвенирование одноядерных РНК
3 мая 2024 г.
Биология межмышечной жировой ткани (IMAT) в значительной степени не изучена из-за ограниченной доступности тканей человека. Здесь мы представляем подробный протокол выделения ядер и подготовки библиотеки замороженного человеческого IMAT для секвенирования одноядерных РНК для определения клеточного состава этого уникального жирового депо.
Наша исследовательская группа пытается понять клеточный состав и специфические для клеток транскрипционные профили межмышечной жировой ткани или IMAT у человека. IMAT на самом деле является эктопическим жировым депо, расположенным между мышечными волокнами и вокруг них. Компьютерная томография и МРТ смогли количественно оценить объем IMAT и недавно показали, что он увеличивается как с возрастом, так и с ИМТ, а также связан с мышечными дегенеративными заболеваниями.
Исследования секретома in vitro недавно показали, что секретируемые IMAT белки обладают способностью влиять на чувствительность к инсулину, воспалительные профили, а также на экспрессию сократительных белков в скелетных мышцах человека. Ограниченное количество ткани IMAT, собранной во время биопсии, и липидная природа адипоцитов делают эту ткань несовместимой с перевариванием тканей и одноклеточной РНК-Seq. Поэтому мы хотели разработать протокол, который выполнял бы выделение ядер на небольших количествах ткани, которые затем можно было бы использовать в последующих одноядерных РНК-секвенациях.
Этот протокол позволит исследователям определить композиционные и клеточно-специфические транскрипционные изменения, которые происходят в IMAT при различных состояниях метаболических заболеваний и в ответ на вмешательства. Мы надеемся, что эта информация будет иметь решающее значение при разработке новых терапевтических стратегий, которые помогут облегчить метаболические заболевания путем прямого воздействия на IMAT или его секретируемые факторы. В этой области крайне не хватает данных о биологии IMAT, его клеточном происхождении и коммуникации с другими клетками, находящимися как внутри, так и за пределами IMAT, а также о его молекулярных реакциях на вмешательства в образ жизни, такие как диета и физические упражнения или фармакотерапия.
Все это ключевые исследовательские вопросы для нашей группы.
Обзор
В данном исследовании изучается клеточный состав и специфические транскрипционные профили межмышечной жировой ткани (IMAT) человека — области, которая менее изучена из-за ограниченного доступа к ткани. Для облегчения идентификации клеточных компонентов в этом уникальном жировом депо представлен подробный протокол изоляции ядер и подготовки библиотек для секвенирования РНК отдельных ядер.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Биология межмышечной жировой ткани (МЖТ)
- Клеточный состав и функции
- Влияние на метаболические заболевания
Теоретические основы
- IMAT представляет собой эктопическое жировое депо, расположенное между мышечными волокнами.
- Его объем увеличивается с возрастом и ИМТ, что коррелирует с дегенеративными заболеваниями мышц.
- Секреция белков из IMAT влияет на чувствительность к инсулину и воспалительные процессы в скелетных мышцах.
Используемые методы
- Выделение ядер из малых образцов ткани IMAT человека
- Секвенирование РНК отдельных ядер
- Разработка протокола работы с богатой липидами жировой тканью
Основные результаты
- Разработан протокол, позволяющий исследователям анализировать клеточно-специфичную транскриптомику IMAT.
- Обеспечена возможность идентификации клеточных изменений при метаболических заболеваниях и в результате терапевтических вмешательств.
- Улучшено понимание роли IMAT в метаболическом здоровье.
Выводы
- Данное исследование дает ценную информацию о биологии IMAT.
- Полученные результаты могут лечь в основу новых терапевтических стратегий, направленных на IMAT при метаболических заболеваниях.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Секвенирование РНК отдельных ядер жировой ткани между мышцами (IMAT) человека позволяет восполнить критический пробел в понимании клеточного состава и транскрипционных состояний, специфичных для данного депо, которые имеют значение при метаболических и дегенеративных заболеваниях мышц. Данный протокол обеспечивает профилирование с высоким разрешением при использовании ограниченного объема биопсийного материала, что повышает прогностическую достоверность на этапах раннего поиска и валидации мишеней для портфелей препаратов по лечению метаболических заболеваний. Такой подход способствует снижению механистических рисков на стыке биологии жировой ткани и мышц, что дает важную информацию для трансляционных исследований и разработки терапевтических стратегий.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать клеточную гетерогенность и транскрипционные программы, специфичные для IMAT.
- Поддерживает функциональную валидацию мишеней путем выявления специфичных для типов клеток профилей экспрессии генов.
- Способствует механистическому снижению рисков для мишеней при заболеваниях мышц и метаболических нарушениях.
- Предоставляет базовые данные для определения приоритетных стратегий вмешательства, специфичных для конкретных депо.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных суспензий ядер, подходящих для высокопроизводительного анализа РНК единичных ядер (single-nuclei RNA-seq).
- Стандартизация обработки образцов, полученных из ограниченного объема биопсии тканей человека с высоким содержанием липидов.
- Обеспечение воспроизводимого обнаружения редких и малочисленных популяций клеток.
- Поддержка количественного транскриптомного анализа для последующей оценки воздействия соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Позволяет соотнести клеточные профили IMAT с метаболическими и мышечными фенотипами, характерными для заболевания.
- Обеспечивает преемственность от этапа исследований на тканях человека до валидации на доклинических моделях.
- Способствует выявлению трансляционных биомаркеров, связанных с биологией IMAT.
- Помогает обосновать продвижение терапевтических программ, нацеленных на депо, с учетом всех рисков.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный протокол изоляции и секвенирования ядер интегрирован в континуум от этапа поиска мишеней до доклинических исследований метаболических и мышечных заболеваний, обеспечивая надежную валидацию мишеней и трансляционную преемственность.
- Поисковая биология: позволяет проверить гипотезы о клеточном составе IMAT и влиянии секретома на мышечную ткань.
- Скрининг: обеспечивает получение стандартизированных, воспроизводимых препаратов ядер для масштабируемых транскриптомных анализов.
- Аналитика: предоставляет количественные данные секвенирования РНК отдельных ядер (single-nuclei RNA-seq) для сравнительного анализа различных патологических состояний и результатов терапевтических вмешательств.
- Трансляционные исследования: позволяет экстраполировать данные, полученные на тканях человека, на разработку доклинических моделей и поиск биомаркеров.
- Практическое применение: устанавливает воспроизводимый протокол для профилирования других сложных жировых депо или ограниченных образцов биопсии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозирования при выборе мишеней, связанных с IMAT, и углубляет понимание механизмов их действия.
- Операционная ценность: Стандартизирует выделение ядер из богатых липидами ограниченных образцов тканей человека для обеспечения воспроизводимости последующего анализа.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении (go/no-go) терапевтических программ, направленных на депо, и снижает биологические риски на поздних этапах разработки.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритезацию активов по лечению метаболических заболеваний и заболеваний мышц с учетом рисков на основе данных по тканям человека.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с тканями, выделения ядер и подготовки библиотек для секвенирования РНК единичных ядер (snRNA-seq).
- Необходим доступ к специализированному оборудованию для подсчета ядер и капельного секвенирования.
- Требуется межкомандная стандартизация процессов обработки образцов и рабочих процессов анализа данных.
- Может потребоваться адаптация для других жировых депо или типов тканей с иным содержанием липидов.
- Ограничено количеством и качеством доступного для анализа биопсийного материала человека.
