Профилирование рН люминала в трехмерных органоидах желудочно-кишечного тракта с помощью микроэлектродов
5 июля 2024 г.
В настоящем протоколе описаны измерения рН в органоидах желудка человека, полученных из тканей человека, с использованием микроэлектродов для пространственно-временной характеристики внутрипросветной физиологии.
Общая цель нашего исследования состоит в том, чтобы понять, как эпителиальные клетки желудка, иммунные клетки, стромальные клетки и их продукты, такие как цитокины и слизь, работают вместе, чтобы ответить на инфекцию желудочного патогена Helicobacter pylori. Для этого мы пытаемся построить сложные физиологически значимые модели слизистой оболочки желудка человека. Предыдущие исследования желудочных органоидов показали противоречивые результаты относительно способности этих моделей поддерживать секрецию кислот в париетальных клетках.
Используя рН-микроэлектроды, мы продемонстрировали, что при отсутствии специфических протоколов дифференцировки или стимуляции органоиды желудка человека поддерживают почти нейтральный рН в просвете. Относительный по доступности, органоидный просвет долгое время ограничивал наше понимание микроокружения внутри. Мы демонстрируем первые успешные измерения pH микроэлектродов для функциональной характеристики органоидов.
Наш метод на основе микроэлектродов может предоставить исследователям надежный инструмент, который можно адаптировать к их конкретным потребностям. До сих пор измерение pH в органоидах желудочно-кишечного тракта включало использование pH-чувствительных красителей, которые полагаются на микроскопическую визуализацию для количественной оценки. Основное преимущество использования микроэлектродов заключается в том, что они обеспечивают точные числовые показания pH.
Кроме того, внутрипросветный pH может регистрироваться в режиме реального времени и с превосходным пространственным разрешением. Мы работаем над созданием полностью функциональной модели слоя желудочной слизи человека с физиологическим градиентом pH, чтобы мы могли изучить роль этого барьера в инфекции Helicobacter pylori. Конечная цель состоит в том, чтобы разработать новые цитопротекторные препараты, которые укрепляют слой слизи и предотвращают бактериальную инвазию.
Обзор
В данном протоколе описывается использование микроэлектродов для измерения pH в органоидах желудка, полученных из тканей человека, что позволяет провести пространственно-временную характеристику физиологии просвета органоида. Целью исследования является углубление понимания реакций эпителия желудка на инфекцию, вызванную Helicobacter pylori.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Гастроэнтерология
- Клеточная биология
Теоретические основы
- Гастральные органоиды используются для моделирования слизистой оболочки желудка человека.
- Предыдущие исследования показали противоречивые результаты в отношении секретирующих кислоту обкладочных клеток.
- Понимание микросреды внутри органоидов имеет решающее значение для изучения физиологии желудка.
- Микроэлектроды представляют собой новый метод точного измерения pH.
Цель исследования
- Разработать надежный метод измерения внутрипросветного pH в органоидах желудка.
- Изучить роль слоя слизи желудка при инфекции Helicobacter pylori.
- Создать модель, которая может привести к разработке новых методов цитопротективного лечения.
Используемые методы
- Подготовка органоидов желудка человека.
- Использование микроэлектродов для измерения pH в режиме реального времени.
- Калибровка микроэлектродов для обеспечения точности показаний.
- Регистрация pH в различных областях органоидов.
Основные результаты
- Органоиды желудка человека поддерживают почти нейтральный pH при отсутствии специальных протоколов.
- Микроэлектроды обеспечивают точное измерение pH и пространственное разрешение.
- В нескольких органоидах наблюдались колебания pH в просвете.
- Данный метод может быть адаптирован под различные исследовательские задачи.
Выводы
- Метод на основе микроэлектродов эффективен для изучения физиологии органоидов желудка.
- Понимание динамики pH может помочь в определении стратегий лечения инфекций желудка.
- Данный подход расширяет возможности разработки новых терапевтических методов вмешательства.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Количественное профилирование pH просвета в трехмерных желудочно-кишечных органоидах с помощью микроэлектродов позволяет проводить точную функциональную характеристику моделей тканей, имеющих значение для изучения заболеваний. Эта возможность повышает прогностическую достоверность на этапах раннего поиска и валидации мишеней в исследованиях биологии слизистой оболочки желудка, особенно при изучении инфекций и барьерной функции. Надежные внутрипросветные измерения обеспечивают трансляционную преемственность от стадии открытия до разработки доклинических моделей в портфелях биофармацевтических исследований и разработок.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет проверять гипотезы о функциях эпителия и барьерной функции в физиологически релевантных органоидных системах.
- Способствует снижению биологических рисков за счет обеспечения прямых количественных показателей изменений микросреды просвета.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней для путей, участвующих в инфекции желудка и защите слизистой оболочки.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подготавливать валидированные модели органоидов для последующего скрининга соединений и изучения механизмов действия.
- Обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые и количественные показатели pH для разработки анализов.
- Обеспечивает мониторинг условий в просвете в режиме реального времени с высоким разрешением для надежной оценки соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет результаты моделирования органоидов с физиологическими параметрами заболевания для разработки трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия in vitro до доклинической валидации моделей инфекции и функций желудочного барьера.
- Поддерживает принятие решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков за счет уточнения механистических основ действия потенциальных терапевтических средств.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод профилирования pH с использованием микроэлектродов интегрируется в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, связывая раннюю проверку гипотез с валидацией трансляционных моделей.
- Открытия в биологии: обеспечивает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей в сложных органоидных системах.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные измерения pH для подготовки и стандартизации анализа.
- Аналитика: предоставляет высокоразрешающие данные в режиме реального времени для сравнения экспериментальных условий и результатов моделирования.
- Трансляционные исследования: связывает результаты in vitro с доклиническими моделями путем приведения в соответствие с физиологическими градиентами pH и барьерной функцией.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для функциональной характеристики в различных исследованиях на основе органоидов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает неопределенность механизмов в исследованиях слизистой оболочки желудка.
- Операционная ценность: стандартизирует измерение pH просвета с помощью масштабируемого и воспроизводимого инструментария.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет уточнения выходных данных функциональных моделей.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию программ поиска и доклинических исследований, направленных на изучение путей инфекции и желудочного барьера, с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами органоидов и эксплуатацией микроэлектродов под управлением микроманипулятора.
- Необходим доступ к калиброванным микроэлектродам, электродам сравнения и совместимому аналитическому программному обеспечению.
- Для обеспечения воспроизводимости требуется стандартизация протоколов измерений между исследовательскими группами.
- Может потребоваться адаптация методики для различных типов органоидов или условий просвета.
- Пространственное разрешение и продолжительность измерений ограничены размером органоида и стабильностью электрода.
