Получение одноклеточной суспензии эпителиальных клеток тимуса мыши и окрашивание внутриклеточных молекул для проточного цитометрического анализа

Т-клетки – это иммунные клетки, которые защищают наш организм от инфекционных заболеваний и рака. Тимус – это орган, который вырабатывает Т-клетки и отбирает развивающиеся Т-клетки в соответствии с компонентами организма. Нас интересует, как тимус производит и отбирает Т-клетки, которые защищают наш организм и в то же время толерантны к нему.

Наша лаборатория внесла свой вклад в анализ эпителиальных клеток тимуса, которые играют ключевую роль в производстве и отборе Т-клеток в тимусе. Анализ эпителиальных клеток тимуса на уровне отдельных клеток помог нам лучше понять молекулярный механизм развития и отбора Т-клеток. Эпителиальные клетки тимуса очень разнообразны и имеют сложную структуру, что затрудняет их выделение.

Современные технологии выделения суспензий одиночных клеток ограничены и нуждаются в совершенствовании. Тем не менее, выделение эпителиальных клеток тимуса отдельными клетками улучшает наше понимание молекулярных механизмов, участвующих в их развитии и функционировании. Мы надеемся, что наше исследование внесет вклад в понимание генерации и регенерации иммунных клеток.

Мы считаем, что это послужит важным краеугольным камнем для улучшения здоровья человека. После сбора тимуса у мыши, поместите его в пять миллилитров RPMI 1640, содержащего 10 миллимолярных HEPES, в 60-миллиметровую пластиковую посуду со льдом. Под препарирующим микроскопом используйте изогнутый пинцет с тонким концом для удаления крови, нетимуса и жировых тканей.

Ножницами для пресечения разрежьте тимус на небольшие кусочки. Переложите кусочки тимуса в 15-миллилитровую пробирку, содержащую три миллилитра одного миллиграмма на миллилитр коллагеназы и диспазы, и одну единицу на миллилитр ДНКазы в RPMI 1640, содержащей 2% FBS. Выдержите трубку на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут.

Затем смешайте суспензию с помощью трехмиллилитровой пластиковой пипетки для переноса и продолжайте инкубацию в течение примерно 30 минут или до тех пор, пока фрагменты ткани не исчезнут. Добавьте пять миллилитров пяти миллимолярных ЭДТА в HBSS, содержащий 1% FBS. Отфильтруйте клеточную суспензию через нейлоновую сетку толщиной 60 микрон в новую 50-миллилитровую трубку.

Центрифугируйте суспензию при 350G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах буфера FACS. Храните клетки на льду и определяйте номера клеток с помощью счетчика клеток. После забора тимуса у неонатальной мыши используйте изогнутый пинцет с тонким концом для удаления крови, невилочковых и жировых тканей.

Перенесите вилочковую железу в 1,5-миллилитровую трубку, содержащую 0,2 миллилитра RPMI 1640, содержащего 10 миллимолярных HEPES. С помощью пипетки объемом 200 микролитров выбросьте среду, затем добавьте 0,5 миллилитра 0,5 миллиграмма на миллилитр коллагеназы и диспазы и одну единицу на миллилитр Dnase в RPMI 1640, содержащую 2% FBS. Инкубируйте трубку в термоблоке при температуре 37 градусов Цельсия.

Во время инкубации аккуратно перемешивайте с помощью пипетки объемом в один миллилитр. Через 10 минут добавьте 0,5 миллилитра пяти миллимолярных ЭДТА в HBSS, содержащий 1% FBS. Отфильтруйте клеточную суспензию через нейлоновую сетку толщиной 60 микрон в новую коническую трубку объемом 15 миллилитров.

Добавьте в тюбик девять миллилитров RPMI 1640, содержащего 10 миллимолярных HEPES. Центрифугируйте клеточную суспензию при 350 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и повторно суспендируйте гранулу в одном-трех миллилитрах буфера FACS. Храните клетки на льду и определяйте номера клеток с помощью счетчика клеток.

Для начала добавьте 16 умножить на 10 в степень 6 неонатальных или постнатальных клеток тимуса мыши в пятимиллилитровую полистирольную трубку с круглым дном. Центрифугируйте клеточную суспензию при 350G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендировать клеточную таблетку в 10 микролитрах рабочей концентрации моноклонального антитела против рецептора ФК в буфере FACS.

Инкубируйте пробирку при температуре четыре градуса Цельсия в течение пяти минут. Добавьте по 40 микролитров моноклонального антитела против CD45, моноклонального антитела против EpCAM, моноклонального антитела против Ly-51 и UEA-1 в буфер FACS. Смешайте содержимое пробирки и выдерживайте при температуре четыре градуса Цельсия в течение 45 минут.

После инкубации добавьте два миллилитра буфера FACS. Центрифугируйте клеточную суспензию при 350G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и повторно суспендируйте гранулу в одном микролитре фиолетового раствора Ghost Dye 510. Перемешайте содержимое тюбика и выдерживайте при температуре четыре градуса Цельсия в течение 30 минут.

Теперь добавьте два миллилитра буфера FACS и центрифугируйте клеточную суспензию перед фиксацией клеток одним миллилитром 2%-ного параформного альдегида в течение 10 минут при комнатной температуре. Добавьте в тюбик 3,5 миллилитра PBS. Центрифугируйте клеточную суспензию при 700 G в течение восьми минут при четырех градусах Цельсия и проникните в клетки одним миллилитром внутриклеточного фиксирующего и пермеабилизационного буфера.

Перемешайте содержимое пробирки и выдерживайте при температуре четыре градуса Цельсия в течение 20 минут. После инкубации центрифугируйте клеточную суспензию и добавьте один миллилитр буфера для пермеабилизации. Снова центрифугируйте суспензию, перед тем как добавить по 100 микролитров каждую из рабочих концентраций антитела против бета5т или антитела против CCL21.

Выдерживать в течение 60 минут при комнатной температуре. Добавьте один миллилитр буфера для пермеабилизации и центрифугируйте клеточную суспензию при температуре 700G в течение восьми минут при четырех градусах Цельсия. Теперь добавьте 100 микролитров рабочих концентраций антикроличьего IgG и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре.

После добавления пермеабилизационного буфера центрифугируйте клеточную суспензию. Суспендируйте клеточную гранулу в 200 микролитрах буфера FACS и хорошо перемешайте. Перед проведением проточного цитометрического анализа клеточную суспензию профильтруйте через нейлоновую сетку толщиной 60 микрон.

Проточные цитометрические профили Collagenase и Dispase расщепленных клеток тимуса у мышей нулевого дня и двухнедельных мышей показали, что более 90% сигналов частиц представляют собой жизнеспособные клетки. Флуоресцентные сигналы жизнеспособных клеток были представлены CD45 и EpCAM. На неонатальных стадиях цТЭО встречались чаще, чем мТЭК, но постнатально преобладали мТЭО из-за низкой эффективности высвобождения цТЭК.

Фиксация и пермеабилизация клеток позволяют обнаруживать внутриклеточные молекулы в ПЭС. Экспрессия бета5t была обнаружена в большинстве цTEC, но не в mTEC. CCL21 был обнаружен в части mTEC, но не в cTEC.

Для сравнения, воздух был экспрессирован в субпопуляции mTEC.