Оценка активности репарации двухцепочечного разрыва ДНК с использованием высокопроизводительных и количественных репортерных анализов на основе люминесценции
14 июня 2024 г.
Мы представляем протоколы для оценки эффективности пути репарации двухцепочечного разрыва в клетках с использованием набора экстрахромосомных репортерных субстратов на основе люминесценции.
Компания Artios разрабатывает новые противораковые препараты, нацеленные на реакцию на повреждение ДНК. Чтобы сделать это возможным, мы разработали ряд новых анализов для измерения активности репарации клеточной ДНК. Эти анализы оказали значительное влияние на наши программы, что привело к тому, что клинические активы были протестированы на пациентах с высокими неудовлетворенными медицинскими потребностями.
Точное измерение целевой клеточной активности имеет важное значение для разработки новых таргетных методов лечения. Создание анализов на факторы репарации ДНК с необходимыми свойствами для стимулирования эффективной кампании по разработке лекарств было сложной задачей, будь то потребность в высокой пропускной способности, надежном соотношении сигнал/шум, быстром обороте и, в идеале, переносимости в различные биологические системы. Мы разработали набор надежных, количественных и титруемых репортерных анализов на основе люминесценции для измерения эффективности четырех основных путей восстановления двухцепочечных разрывов: гомологичной рекомбинации, негомологичного соединения концов, микрогомологически опосредованного соединения концов и одноцепочечного отжига.
Эти репортерные анализы подтверждены как считывающие репарацию, зависящую от пути, чувствительны к фармакологической модуляции и имеют быстрое время выполнения. Разработанные нами ремонтные подложки являются внехромосомными, поэтому их можно временно трансфицировать в интересующие модели и легко масштабировать в формат с высокой пропускной способностью. Мы считаем, что наши системы анализа играют важную роль в открытии лекарств для РДР, а также в углублении нашего понимания биологии РДР в более широком смысле.
В связи с этим мы надеемся, что эти методы помогут ускорить выявление и преследование новых мишеней для лекарств, что приведет к созданию лекарств для лечения таких заболеваний, как рак, где существует высокая неудовлетворенная медицинская потребность.
Обзор
В данной статье представлены протоколы для оценки компетентности путей восстановления разрывов двойной цепочки в клетках с использованием внехромосомных репортерных субстратов на основе люминесценции. Разработанные анализы имеют решающее значение для понимания реакции на повреждение ДНК и содействия открытию новых лекарств в онкологии.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Реакция на повреждение ДНК
- Механизмы клеточного восстановления
- Открытие онкологических лекарств
Бэкграунд
- Разрывы двойной цепочки в ДНК являются критическими поражениями, которые требуют эффективного восстановления.
- Понимание путей восстановления важно для разработки целенаправленных терапий рака.
- Существующие анализы для измерения активности восстановления ДНК имеют ограничения по пропускной способности и чувствительности.
- Новые анализы могут улучшить усилия по открытию лекарств, точно измеряя клеточную активность.
Цель исследования
- Разработать надежные анализы для измерения компетентности в основных путях восстановления разрывов двойной цепочки.
- Способствовать идентификации новых целевых объектов лекарств в лечении рака.
- Улучшить понимание биологии реакции на повреждение ДНК.
Используемые методы
- Разработка репортерных анализов на основе люминесценции для четырех путей восстановления.
- Транзиентная трансфекция внехромосомных субстратов в клеточные модели.
- Измерение люминесцентных сигналов для оценки компетентности восстановления.
- Валидация анализов на чувствительность к фармакологической модуляции.
Основные результаты
- Анализ показал зависимую от пути активность восстановления.
- Количественные измерения показали чувствительность к модуляции лекарствами.
- Достигнуты быстрые сроки выполнения анализов.
- Анализ могут быть масштабированы для высокопроизводительного скрининга.
Выводы
- Разработанные анализы являются ценными инструментами для открытия лекарств в онкологии.
- Они улучшают понимание механизмов восстановления ДНК.
- Эти методы могут ускорить идентификацию новых терапевтических целей.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Quantitative luminescence-based reporter assays for DNA double strand break repair enable high-throughput, pathway-specific measurement of cellular DNA repair activity, directly supporting target validation and mechanistic de-risking in oncology drug discovery. These assays provide rapid, reproducible, and scalable outputs essential for advancing DNA damage response (DDR) therapeutics. Their integration into discovery pipelines enhances predictive confidence and portfolio triage for DDR-targeted assets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of DDR pathway activity for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing pathway-specific repair proficiency.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and biological relevance.
- Accelerates identification and prioritization of novel DDR drug targets.
Screening & Assay Development
- Provides validated, quantitative readouts for robust assay standardization.
- Delivers high-throughput, scalable formats suitable for compound screening.
- Ensures reproducibility and titratability across diverse biological systems.
- Enables reliable evaluation of pharmacological modulation of DNA repair pathways.
Translational & Preclinical Research
- Aligns pathway-specific repair measurements with disease-relevant DDR biology.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of DDR targets.
- Informs risk-adjusted advancement decisions for DDR-focused portfolios.
- Provides mechanistic insights to guide translational biomarker strategies.
Pipeline & Workflow Integration
These assays position within the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical evaluation of DDR-targeted therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for DDR mechanisms.
- Screening: Delivers assay readiness, reproducibility, and quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Provides sensitive luminescence measurements to compare repair activity across conditions.
- Translational Research: Enables alignment of cellular repair proficiency with disease models when relevant.
- Enterprise Reuse: Offers a portable, scalable platform adaptable to multiple cell systems and discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in DDR target validation.
- Operational Value: Standardizes and accelerates assay workflows with high-throughput scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust biological readouts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of DDR-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology and luminescence assay design.
- Needs access to luminescence plate readers and standard cell culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization for assay reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various cell models via transient transfection of extrachromosomal substrates.
- Dependent on validated controls to distinguish pathway-specific repair activity.
