Иммуноокрашивание по всему массиву и автоматический подсчет ганглиозных клеток сетчатки мыши
4 октября 2024 г.
Этот протокол описывает процедуру выделения сетчатки мыши целиком и выполнения иммуноокрашивания для мечения всех ганглиозных клеток сетчатки (РГК). За этим процессом следует визуализация и автоматический подсчет RGC с помощью программного обеспечения на основе искусственного интеллекта, что обеспечивает простой, быстрый и точный метод количественного определения RGC во всей сетчатке мыши.
Цель нашего исследования заключается в использовании мыши в качестве животной модели для изучения глаукомы. Чтобы точно оценить состояние глаукомы в сетчатке мыши, нам необходимо определить, сколько ганглиозных клеток сетчатки находится в сетчатке. Существует около 50 000 ганглиозных клеток сетчатки во всей сетчатке мыши.
Если считать их вручную, то может потребоваться от восьми до 10 часов. Автоматические методы подсчета могут сделать это за считанные минуты и сэкономить людям много времени и усилий. В будущем наша лаборатория сосредоточится на изучении лечения глаукомы.
Мы собираемся использовать различные модели мышей для лечения глаукомы, чтобы протестировать различные методы лечения. Метод, описанный в этом протоколе, особенно полезен для оценки лечения.
Обзор
В данном исследовании представлен протокол выделения сетчатки мыши целым препаратом и проведения иммуноокрашивания для маркировки ганглионарных клеток сетчатки (ГКС). Использование программного обеспечения на базе ИИ для автоматического подсчета позволяет быстро и точно количественно определить число ГКС, что способствует изучению таких состояний, как глаукома.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Анатомия сетчатки
- Исследования глаукомы
Теоретические сведения
- Ганглионарные клетки сетчатки имеют решающее значение для обработки зрительной информации.
- Ручной подсчет ганглионарных клеток сетчатки может быть трудоемким и занимать много времени.
- Автоматизация подсчета с помощью ИИ является перспективной альтернативой.
- Понимание механизмов потери ганглионарных клеток сетчатки жизненно важно для изучения глаукомы.
Цель исследования
- Разработать метод экспресс-количественного определения ганглионарных клеток сетчатки.
- Способствовать исследованию глаукомы путем эффективной оценки потери RGC.
- Использовать автоматизированные инструменты для повышения точности подсчета клеток.
Используемые методы
- Основная платформа включает выделение сетчатки целым препаратом и иммуноокрашивание.
- В качестве биологической модели используется сетчатка мыши, в частности, в контексте глаукомы.
- Ключевые этапы включают фиксацию, инкубацию с антителами и обработку изображений с помощью программного обеспечения на базе ИИ.
- В протоколе особое внимание уделяется осторожной диссекции и обращению с сетчаткой для сохранения целостности ткани.
Основные результаты
- Автоматизированный подсчет позволил точно идентифицировать более 15 000 RGC в мышиной модели глаукомы.
- Наблюдалась значительная потеря клеток по сравнению со здоровой сетчаткой, которая содержит примерно 50 000 RGC.
- Данный метод повышает эффективность и снижает количество ошибок при ручном подсчете клеток.
Выводы
- В исследовании представлен оптимизированный подход к количественному определению RGC с использованием ИИ.
- Данный метод открывает перспективы для развития исследований в области лечения глаукомы и поддержания здоровья сетчатки.
- Результаты имеют важное значение для понимания механизмов потери RGC и разработки потенциальных методов терапии заболеваний сетчатки.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Количественная оценка потери ганглионарных клеток сетчатки (ГКС) имеет решающее значение для доклинических исследований глаукомы и оценки эффективности терапии. Автоматизированное иммуноокрашивание целого препарата и подсчет клеток на основе ИИ позволяют проводить быстрый, воспроизводимый и масштабируемый анализ дегенерации ГКС на моделях мышей. Эта возможность повышает прогностическую уверенность в воздействии на мишень и эффективности лечения на этапах поиска кандидатов и трансляционных исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает точную количественную оценку потери RGC для изучения механизмов нейродегенерации в моделях глаукомы.
- Поддерживает функциональную валидацию нейропротекторных мишеней путем измерения показателей выживаемости клеток.
- Способствует снижению механистических рисков, предоставляя объективные данные по всей сетчатке для проверки гипотез.
Скрининг и разработка методов анализа
- Обеспечивает стандартизированный и воспроизводимый подсчет RGC для разработки анализов и рабочих процессов скрининга соединений.
- Позволяет проводить высокопроизводительную оценку потенциальных терапевтических средств, сокращая время ручного подсчета с часов до минут.
- Предоставляет количественные данные, пригодные для сравнения результатов различных исследований и моделей.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит количественную оценку RGC на доклиническом этапе в соответствие с конечными точками, значимыми для исследования глаукомы.
- Обеспечивает преемственность от этапа поиска до доклинической валидации за счет возможности последовательного измерения нейродегенерации.
- Оптимизирует принятие решений о продвижении разработки с учетом рисков, предоставляя надежные и объективные данные об эффективности.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в цикл исследований от этапа поиска до доклинических испытаний, обеспечивая поддержку как ранних механистических исследований, так и поздних этапов оценки эффективности на моделях глаукомы у мышей.
- Биологические исследования: позволяет проводить проверку гипотез о нейродегенеративных путях и валидацию мишеней in vivo.
- Скрининг: обеспечивает получение готовых к анализу количественных данных о числе RGC для оценки соединений и изучения зависимости «доза-эффект».
- Аналитика: генерирует воспроизводимые автоматизированные подсчеты клеток для статистического сравнения экспериментальных групп.
- Трансляционные исследования: связывают этап поиска мишеней и доклиническую фазу путем сопоставления показателей потери RGC с прогрессированием заболевания и терапевтическими конечными точками.
- Корпоративное использование: предлагает масштабируемый стандартизированный рабочий процесс, адаптируемый к различным моделям нейродегенерации и схемам разработки терапевтических средств.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность валидации нейропротекторных мишеней и эффективности лечения.
- Операционная ценность: Сокращает объем ручного труда, увеличивает пропускную способность и стандартизирует количественную оценку RGC в различных исследованиях.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает принятие обоснованных решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и сортировку портфеля проектов на основе объективных количественных данных.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию нейропротекторных кандидатов и трансляционных программ с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в препарировании сетчатки, иммуногистохимическом окрашивании и анализе изображений.
- Необходим доступ к флуоресцентному микроскопу и программному обеспечению для подсчета клеток на основе ИИ.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов обработки тканей и визуализации.
- Метод может быть адаптирован для других моделей нейродегенерации при соответствующем подборе антител.
- Особое внимание при работе с тканями необходимо для предотвращения появления артефактов, которые могут повлиять на автоматизированный количественный анализ.
