Белковая инженерия с помощью дисплея поверхности дрожжей

В моей лаборатории мы разрабатываем клеточную терапию нового поколения, сочетая белковую инженерию с клеточной инженерией. Таким образом, мы разрабатываем белковые компоненты для получения новых функций или улучшения существующих, а затем включаем эти нулевые белки в клеточную терапию. Мы усовершенствовали использование поверхностного отображения для специализированных приложений, включая инженерию стабильности белков, разработку низкомолекулярных регулируемых белковых переключателей и специфическое нацеливание на подтверждения активированных рецепторов, связанных с раком.

Преимущество дисплея поверхности дрожжей по сравнению с другими технологиями отображения, такими как фаговый или рибосомный дисплей, заключается в проточной цитометрической визуализации библиотеки в процессе сортировки и точном контроле условий отбора, таких как концентрация антигена и строгость сортировочных ворот. Для начала подготовьте бусины для первого выбора бусин, суспендировав 10 микролитров магнитного бисера со связующим биотином в 990 микролитрах PBSA. Для мытья поместите тюбик на магнитную решетку на две минуты с открытой крышкой.

Затем аккуратно удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте промытые шарики в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитра в одном миллилитре PBSA с 6,7-33 пикомолами биотинилированного антигена. После инкубации поместите пробирку на магнитный штатив на две минуты с открытой крышкой, удалите надосадочную жидкость и промойте наполненные антигеном шарики одним миллилитром PBSA.

Как только бусины осядут, удалите PBSA. Затем повторно суспендируйте наполненные антигеном шарики в 50 микролитрах PBSA. Подготовьте клетки, шарики антигена и раствор медвежьих бусин для негативных выделений.

После промывки ресуспендировать антигенные бусины в 50 микролитрах PBSA и повторно суспендировать медвежьи бусины в 150 микролитрах PBSA. Для первого отрицательного отбора добавьте 50 микролитров промытых голых бусин в 950 микролитров отмытых ячеек в PBSA и выдержите смесь в течение 1,5 часов при четырех градусах Цельсия. После инкубации поместите пробирки, содержащие суспензию клеток медвежьих бусин, на магнитный штатив с открытой крышкой.

Налейте пипеткой в пробирку любую жидкость из крышки, и подождите две минуты. Затем переложите несвязанные ячейки в свежую микроцентрифужную пробирку и добавьте 50 микролитров промытых медвежьих бусин. После трех раундов отрицательного отбора добавьте в клетки 50 микролитров раствора, наполненного антигеном.

Выдерживать в течение двух часов при температуре четыре градуса Цельсия. Теперь поместите клетки, содержащие наполненные антигеном шарики, на магнитный штатив с открытой крышкой. Пипеткой закачайте в пробирку любую жидкость, которая находится в крышке.

Подождите две минуты, прежде чем отбрасывать несвязанные ячейки. Выполните все оставшиеся шаги, как описано для первого выбора бусины антигена. После трех отрицательных и одного положительного отбора быстро ресуспендируйте клетки в одном миллилитре SDCAA и перенесите в колбу-шейкер, содержащую больший объем SDCAA.

После ночной индукции поверхностной экспрессии белков в SGCAA в библиотеках дрожжей соберите достаточное количество клеток, чтобы покрыть в 10 раз большее разнообразие, и отбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу в PBSA и переложите ее в микроцентрифужные пробирки. Используйте 30 миллионов ячеек для окрашивания в каждой пробирке.

Подготовьте столько пробирок, сколько требуется в зависимости от разнообразия, включая одну контрольную пробирку без антигена. Затем центрифугируйте пробирки при 2000 х г в течение пяти минут при комнатной температуре. Ресуспендируйте гранулу в 200 микролитрах PBSA, содержащей антиген, и инкубируйте в течение одного часа при четырех градусах Цельсия.

После повторного выполнения центрифугирования удалите PBSA из гранулы. Затем ресуспендируют клетки в 100 микролитрах холодного PBSA, содержащего антитела для окрашивания дисплея и обнаружения антигена. Выдерживать в течение 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия.

После инкубации центрифугируйте клетки при температуре 2000 x g в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Добавьте в гранулу один миллилитр PBSA и повторите центрифугирование. Затем удалите большую часть надосадочной жидкости, оставив всего от 20 до 30 микролитров, чтобы не допустить пересыхания гранул.

Суспендируйте гранулу в холодном PBSA непосредственно перед сортировкой. Теперь отсортируйте клетки непосредственно в среду SDCAA. После сортировки перенесите клетки в колбу шейкера, содержащую больший объем среды SDCAA, и инкубируйте при температуре 30 градусов Цельсия с встряхиванием при 180 об/мин.