Гибридный ансамблевый и одномолекулярный анализ для визуализации движения полностью восстановленного КМГ
26 июля 2024 г.
Мы сообщаем о гибридном ансамбле и анализе одной молекулы для непосредственного изображения и количественной оценки движения флуоресцентно меченных, полностью восстановленных геликаз Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) на линейных молекулах ДНК, удерживаемых на месте в оптической ловушке.
Мы изучаем динамику движения различных компонентов эукариотической репликимы на уровне одной молекулы. Для того, чтобы получить глубокое количественное понимание того, как клетки могут дублировать весь свой геном, каждый клеточный цикл. В 2015 году репликация эукариотической ДНК была полностью восстановлена in vitro из очищенных белковых компонентов.
И это дало нам большой контроль над системой. И с тех пор он широко используется для ответа на вопросы о различных стадиях репликации ДНК с увеличением временного и пространственного разрешения. И это было сделано с помощью взаимодополняющих подходов, таких как крио-ЭМ и биофизика одиночных молекул.
В области одиночных молекул одной из самых больших проблем с этой системой является количество задействованных белков, а также концентрации, при которых эти компоненты необходимы для максимизации эффективности всей реакции, поскольку это может усложнить визуализацию одной молекулы. Описанный здесь протокол представляет собой гибридный подход, при котором белковый комплекс сначала эффективно собирается с использованием ансамблевой биохимии, а затем вводится и изучается в условиях одной молекулы. Это позволяет избежать введения двух высоких концентраций белка на уровне одной молекулы.
Мы иллюстрируем этот подход для изучения поведения репликативной геликазы CMG на уровне ДНК на уровне одной молекулы после ее сборки по исходному пути. Но этот подход также может быть использован для изучения динамики многих других типов ДНК-связывающих белковых комплексов.
Обзор
В данном исследовании представлен гибридный метод, сочетающий ансамблевый анализ и анализ отдельных молекул, для изучения динамики движения хеликазы CMG на линейной ДНК. Объединяя методы ансамблевой биохимии и визуализации отдельных молекул, авторы стремятся углубить понимание процессов репликации ДНК.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биохимия
- Молекулярная биология
Теоретические основы
- Репликация эукариотической ДНК может быть реконструирована in vitro с использованием очищенных белков.
- Методы анализа одиночных молекул позволяют глубже понять сложные биологические процессы.
- Среди проблем — подбор концентраций белков для эффективной визуализации.
- Хеликаза CMG играет ключевую роль в расплетении ДНК в ходе репликации.
Цель исследования
- Количественно оценить движение хеликазы CMG по ДНК.
- Разработать метод, позволяющий минимизировать использование высоких концентраций белка при проведении одномолекулярных исследований.
- Изучить динамику связывания белковых комплексов с ДНК.
Используемые методы
- Сборка белковых комплексов с использованием методов ансамблевой биохимии.
- Одномолекулярная визуализация в сочетании с методами оптического захвата.
- Функционализация линейных ДНК-субстратов для проведения анализов на связывание.
- Последовательные этапы промывки и инкубации для подготовки образцов к визуализации.
Основные результаты
- Успешная визуализация движения хеликазы CMG по ДНК.
- Демонстрация эффективности гибридного подхода в изучении динамики белков.
- Количественные данные о поведении хеликазы в процессе репликации ДНК.
- Потенциальные возможности применения данного метода для других ДНК-связывающих белков.
Выводы
- Гибридный анализ представляет собой мощный инструмент для изучения механизмов репликации ДНК.
- Полученные данные могут быть использованы в будущих исследованиях репликации ДНК эукариот.
- Данный подход может быть адаптирован для различных белковых комплексов, участвующих в процессах с участием ДНК.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Количественная визуализация динамики полностью реконструированной хеликазы CMG позволяет снизить механистические риски на самых ранних этапах валидации мишеней репликации ДНК. Этот гибридный анализ ансамблей и отдельных молекул обеспечивает беспрецедентное разрешение для детального изучения сложных этапов сборки и активации белков, что повышает прогностическую уверенность в мишенях репликации ДНК на стадии поиска. Данный подход непосредственно применим для биофармацевтических групп, стремящихся провести сортировку мишеней аппарата репликации и оптимизировать стратегии идентификации ведущих соединений.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Обеспечивает возможность прямого изучения механизмов сборки и активации CMG с одномолекулярным разрешением.
- Поддерживает функциональную валидацию мишеней путем количественного анализа движения хеликазы и точности сборки.
- Способствует механистическому снижению рисков при выборе мишеней репликации ДНК перед проведением последующего скрининга.
- Предоставляет платформу для выяснения зависимостей путей в сложных белково-нуклеиновых системах.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение валидированных реконструированных биологических систем для надежной разработки последующих методов анализа.
- Позволяет стандартизировать условия визуализации отдельных молекул для получения воспроизводимых количественных результатов.
- Облегчает подготовку к скринингу за счет минимизации мешающих эффектов, вызванных высокими концентрациями белка.
- Обеспечивает возможность масштабируемой адаптации к другим белковым комплексам, перерабатывающим ДНК.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет понимание механизмов с процессами репликации ДНК, имеющими значение для заболевания, где это применимо.
- Обеспечивает преемственность от молекулярных открытий до валидации мишеней репликации на доклинических моделях.
- Позволяет принимать решения о дальнейшем продвижении с учетом рисков на основе количественных данных, полученных методом анализа отдельных молекул.
- Способствует прогностическому снижению рисков при разработке трансляционных биомаркеров путей стресса репликации.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Этот гибридный анализ объединяет ансамблевую биохимию и визуализацию отдельных молекул, располагаясь на стыке этапов первичного поиска и идентификации ведущих соединений для мишеней репликации ДНК.
- Биология открытий: Количественно определяет сборку, активацию и движение CMG для выяснения механизмов путей репликации.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые количественные показатели для оценки потенциальных модуляторов аппарата репликации.
- Аналитика: Позволяет проводить высокоразрешающие измерения динамики хеликазы и состояний сборки для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: Способствует механистическому сопоставлению с моделями заболеваний, связанными с репликативным стрессом или геномной нестабильностью.
- Корпоративное использование: Адаптируемо для других многобелковых комплексов процессинга ДНК для широкого применения в сфере НИОКР.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неоднозначность при валидации мишеней репликации.
- Операционная ценность: стандартизирует сложные рабочие процессы сборки белков и визуализации для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: служит основанием для принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет снижения рисков на ранних этапах изучения мишеней.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию мишеней репликации ДНК для дальнейшего продвижения с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области биохимии ансамблей и методов визуализации одиночных молекул.
- Необходим доступ к инфраструктуре двухлучевых оптических пинцетов и конфокальной микроскопии.
- Требуется строгая межгрупповая стандартизация протоколов очистки белков и функционализации ДНК.
- Адаптация метода для других белковых комплексов может потребовать оптимизации условий сборки и визуализации.
- Чистота белка и контроль агрегации имеют решающее значение для получения достоверных количественных данных.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:41
Binding of Doubly Functionalized Linear DNA Substrate to Streptavidin‐Coated Magnetic Beads
3:59
Ensemble Assembly and Activation of Fluorescently Labeled CMG onto Magnetic Bead‐Bound DNA for Single Molecule Imaging
7:16
Single‐Molecule Imaging of Fully Reconstituted CMG with Correlative Dual‐Beam Optical Tweezers and Confocal Microscopy
