Визуализация реакции на повреждение ДНК в клетках Пуркинье с использованием мозжечковых органотипических культур
27 декабря 2024 г.
Мозжечковые клетки Пуркинье (ПК) особенно чувствительны к дефициту в ответе на повреждение ДНК. Представлен протокол визуальной оценки динамики ответа ПК на повреждение ДНК, который включает окрашивание связанных с белками поли(АДФ-рибозных) цепей в мозжечковых органотипических культурах.
Наша работа сосредоточена на понимании генетического заболевания человека, называемого атаксией-телеангиэктазией, или сокращенно А-Т. Это вызвано потерей протеинкиназы ATM. ATM имеет много функций, и A-T характеризуется многими симптомами, но основным симптомом A-T является прогрессирующая мозжечковая дегенерация, и в настоящее время неясно, какая из многих функций белка ATM является той, потеря которой конкретно ответственна за этот разрушительный симптом.
Мы пытаемся исследовать эту центральную проблему в исследованиях А-Т, и для этого мы используем мозжечковые органотипические культуры, полученные от мышей дикого типа и мышей с дефицитом ATM. Они позволяют нам сосредоточиться на типе клеток, который, вероятно, первым теряется в перерождающемся мозжечке пациентов с А-Т — клетках Пуркинье. Как и во многих других областях медико-биологических наук, исследования в области A-T с использованием различных передовых техник и методов.
Эти методы включают в себя животные модели, новые типы тканевых культур, индуцированные полиплоидные стволовые клетки, передовые технологии визуализации, индуцированные омические методы и визуализацию отдельных клеток. Источником ухудшения состояния мозжечка при А-Т является повреждение клеток Пуркинье. Эти клетки, как известно, трудно изолировать, и они не могут выжить в культурах без поддержки других типов клеток.
Уникальной экспериментальной задачей является получение зрелых, функционирующих клеток Пуркинье человека с использованием технологии индуцированных полиплоидных стволовых клеток. Поскольку выращивание изолированных клеток Пуркинье в настоящее время невозможно, мозжечковые органотипические культуры предоставляют ценную возможность для изучения этих клеток в культуральной чашке в контексте естественной ткани. Использование корреляции белков в качестве считывания ответа на повреждение ДНК очень информативно, особенно в отношении клеток Пуркинье.
Основной функцией протеинкиназы ATM является регулирование реакции на повреждение ДНК, которая имеет решающее значение для поддержания целостности генома и клеточного гомеостаза перед лицом продолжающегося повреждения ДНК, которое происходит в каждой клетке. Нам необходимо точно определить критическое повреждение ДНК, репарация которого в ATM-дефицитных клетках Пуркинье является дефектной, и мы надеемся сделать это с использованием органотипических культур мозжечка. Это должно позволить нам лучше понять физиологическую и молекулярную основу самого важного и разрушительного симптома А-Т – мозжечковой дегенерации.
Обзор
В данном исследовании изучаются механизмы мозжечковой дегенерации при атаксии-телеангиэктазии (A-T) — генетическом заболевании, вызванном потерей протеинкиназы ATM. С помощью органотипических культур мозжечка мышей дикого типа и мышей с дефицитом ATM с помощью анализа корреляции белков оценивается динамика ответов клеток Пуркинье на повреждение ДНК.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Генетика атаксии-телеангиэктазии
- Церебеллярная дегенерация и ее основные механизмы
- Ответ на повреждение ДНК в нейрональных клетках
Обзор
- Атаксия-телеангиэктазия характеризуется прогрессирующей дегенерацией мозжечка.
- Понимание роли белка ATM в репарации повреждений ДНК имеет решающее значение для понимания патологии A-T.
- Клетки Пуркинье одними из первых подвергаются дегенерации при этом состоянии.
Используемые методы
- Использование органотипических культур мозжечка на моделях мышей.
- Применение химических веществ, повреждающих ДНК, для оценки клеточных ответов.
- Методы расширенной визуализации и окрашивания белков для анализа.
Основные результаты
- Доказательства нарушения ответа на повреждение ДНК в клетках Пуркинье с дефицитом ATM.
- Идентификация критических повреждений ДНК, связанных с клеточной дисфункцией.
- Представления о уязвимости клеток Пуркинье и последующей дегенерации при А-Т.
Выводы
- Данное исследование разъясняет связь между функциями белка ATM и дегенерацией мозжечка при А-Т.
- Полученные результаты способствуют более глубокому пониманию реакций нейронов на повреждение ДНК.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Понимание механизмов ответа на повреждение ДНК (DDR) в клетках Пуркинье мозжечка имеет решающее значение для снижения рисков при выборе мишеней для терапии нейродегенерации и выяснения механизмов развития заболеваний при синдромах геномной нестабильности, таких как атаксия-телеангиэктазия. Использование органотипических культур мозжечка позволяет напрямую визуализировать динамику DDR в физиологически релевантном контексте, что повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней и механистических исследованиях. Данный подход помогает принимать обоснованные решения на ранних этапах поиска и приоритизировать портфель программ по изучению нейродегенеративных заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать пути DDR в подтипах нейронов, имеющих значение для патологии заболеваний.
- Способствует механистическому снижению рисков путем выяснения ATM-зависимых процессов репарации в клетках Пуркинье.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней для исследовательских портфелей по нейродегенерации.
Скрининг и разработка анализа
- Предоставляет валидированную систему ex vivo для количественной визуализации маркеров DDR, таких как цепи PAR.
- Обеспечивает воспроизводимую оценку ответов на генотоксический стресс в сложных тканевых средах.
- Поддерживает стандартизацию анализа для последующего скрининга соединений, нацеленных на пути DDR.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям, релевантным конкретным заболеваниям, для разработки трансляционных биомаркеров нейродегенерации.
- Сохраняет архитектуру ткани, обеспечивая преемственность от этапа поиска до доклинической валидации.
- Снижает трансляционный риск за счет моделирования клеточной уязвимости, характерной для человека.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод связывает этап раннего поиска и доклинические исследования, позволяя проводить гипотетически обоснованные исследования DDR в контексте нативной ткани, что способствует идентификации перспективных соединений-лидеров и механистической валидации.
- Биология открытий: облегчает проверку гипотез о функции ATM и целостности пути DDR в клетках Пуркинье.
- Скрининг: обеспечивает количественные, воспроизводимые результаты визуализации для анализа маркеров DDR.
- Аналитика: предоставляет измеримые показатели связанных с белками цепей PAR для сравнительных исследований.
- Трансляционные исследования: связывает механистические выводы с фенотипами нейродегенерации, имеющими значение для заболевания.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу для исследований DDR по различным мишеням нейродегенеративных заболеваний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней DDR и обеспечивает ясность механизмов действия.
- Операционная ценность: стандартизирует анализы на основе тканей для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: служит основанием для принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и снижает биологические риски на поздних этапах разработки препаратов для лечения нейродегенерации.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию терапевтических стратегий, модулирующих DDR, с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в подготовке органотипических культур и владение современными методами визуализации.
- Необходим доступ к флуоресцентной микроскопии и инфраструктуре для количественного анализа изображений.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов обработки тканей и окрашивания.
- Может потребоваться адаптация для других подтипов нейронов или моделей заболеваний.
- Методы считывания на основе визуализации ограничивают анализ маркерами DDR, доступными для микроскопии.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
3:12
Isolation of Cerebellum from Mouse Pups for Obtaining Organotypic Cultures to Study DNA Damage Response
4:31
Preparation of Cerebellar Organotypic Cultures for Investigating DNA Damage Response in Purkinje Cells
5:50
Treatment of Cerebellar Organotypic Cultures with DNA Damaging Agents for Fluorescent Imaging of PAR Chains to Assess Genotoxic Stress Response
