Проведение полногеномного скрининга CRISPR in vitro в Т-клетках химерного антигенного рецептора

Терапия Car T-клетками – это инновационный вид иммунотерапии рака, который привел к ремиссиям продолжительностью более десяти лет. Тем не менее, показатели устойчивых ответных мер все еще ограничены. С помощью этого протокола мы стремимся улучшить наше понимание механизмов резистентности и создать инструменты для улучшения ответа на терапию CAR-Т-клетками.

В настоящее время используется множество подходов для улучшения терапии CAR-T-клетками, включая комбинированную терапию и оптимизацию дизайна CAR. Тем не менее, в связи с растущим количеством доказательств того, что эпигенетический профиль продуктов CAR T-клеток до инфузии является важной определяющей реакцией, технологии генетического редактирования стали популярными инструментами.

Геномное редактирование CAR-T-клеток показало успех в предотвращении токсичности и увеличении роста и персистенции CAR-T-клеток в доклинических и клинических исследованиях. Наш протокол полногеномного нокаут-скрининга CRISPR обеспечивает эффективный и непредвзятый подход к определению наилучших генетических изменений для улучшения функции CAR-Т-клеток.

Полногеномные возмущения генов требуют крупномасштабных и адекватных условий отбора, чтобы быть эффективными. Чтобы изучить развитие истощения CAR-T-клеток, мы узнали, что для выбора оптимальных изменений генов необходимо стимулировать более 80 миллионов CAR-T-клеток в течение двух недель.

В то время как наш протокол был разработан для оценки развития истощения, этот протокол может быть скорректирован для оценки развития других механизмов резистентности. Проводя полногеномный скрининг в различных условиях, мы можем в конечном итоге определить наилучшие изменения для улучшения общего ответа на терапию CAR-Т-клетками.

[Рассказчик] После трансдукции CAR-Т-клеток с помощью библиотеки CRISPR центрифугируйте образцы при 300 г в течение пяти минут при 4 градусах Цельсия, чтобы промыть их. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте образцы в 20 миллилитрах Т-клеточной среды. Чтобы сохранить образцы для секвенирования следующего поколения, аликвотируйте достаточное количество CAR-Т-клеток в 50-миллилитровую коническую пробирку, чтобы поддерживать представление направляющей РНК в 500 клеток на направляющую РНК. Центрифугируйте образец при 300 г в течение пяти минут при температуре 4 градуса Цельсия. Затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре PBS и переложите ее в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку. Промойте 50-миллилитровую коническую пробирку одним миллилитром PBS и переложите промывку в ту же микроцентрифужную пробирку. Затем центрифугируйте образцы при плотности 500 г в течение пяти минут при температуре 4 градуса Цельсия. Удалите надосадочную жидкость и храните клеточные гранулы при температуре -20 градусов Цельсия. Чтобы начать совместное культивирование, добавьте CAR-T-клетки к CD19-положительным клеткам JeKo-1 в соотношении один к одному. Доведите общий объем совместной культуры до 160 миллилитров с Т-клеточной средой и храните образцы в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа. Чтобы повторно стимулировать CAR-Т-клетки, соберите сокультуры в 50-миллилитровые конические пробирки и центрифугируйте образцы при 300 г в течение пяти минут при 4 градусах Цельсия. Ресуспендируйте каждый образец в 80 миллилитров Т-клеточной среды и добавьте 80 раз по 10 в размере шести JeKo-1 клеток в 80 миллилитров Т-клеточной среды. Храните образцы в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа. На 15-й день, чтобы выделить CAR-Т-клетки из совместной культуры, сначала подсчитайте клетки. Комбинируйте набор для положительного отбора CD4-положительных Т-клеток с набором для положительного отбора CD8-положительных Т-клеток для выделения Т-клеток из сокультур CAR T JeKo-1. Затем подсчитайте выделенные Т-клетки. Чтобы сохранить образцы для секвенирования следующего поколения, аликвот 33 умножить на 10 в степень шести CAR-Т-клеток в 50-миллилитровую коническую пробирку и центрифугировать образец при 300 г в течение пяти минут при 4 градусах Цельсия. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре PBS и переложите ее в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку. Затем промойте 50-миллилитровую коническую пробирку одним миллилитром PBS и переложите промывку в ту же микроцентрифужную пробирку. После центрифугирования образцов и удаления надосадочной жидкости храните клеточные гранулы при температуре -20 градусов Цельсия. Для начала выделите геномную ДНК из замороженных гранул CAR-Т-клеток с помощью набора для выделения геномной ДНК. Очистите выделенную геномную ДНК с помощью осаждения этанола путем предварительного охлаждения 100% этанола до -20 градусов Цельсия. Равномерно распределите элюированную ДНК по нескольким микроцентрифужным пробиркам, следя за тем, чтобы каждая аликвота составляла от 200 до 250 микролитров. Добавьте два объема предварительно охлажденного 100% этанола, 0,1 объема трех моляров ацетата натрия и один микролитр 20 мг на миллилитр гликогена. Инкубируйте образцы в течение ночи при температуре -20 градусов Цельсия. На второй день вращайте образцы до 13 000 г в течение 20 минут, чтобы гранулировать осажденную ДНК. Удалите надосадочную жидкость и промойте гранулы одним миллилитром 70% этанола путем отжима при температуре 7 500 г в течение 10 минут. После полного высыхания гранул повторно суспендируйте гранулы в 50 микролитрах стерильной воды. Чтобы подготовить геномную ДНК к секвенированию следующего поколения, необходимо провести ПЦР с указанной реакционной смесью, показанной здесь. Затем проведите ПЦР, используя следующие условия цикличности. Извлеките ПЦР-реакции для каждого образца и очистите продукт ПЦР с помощью набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями производителя. Запустите три микрограмма продукта ПЦР для каждого образца на 2% агарозном геле. Удалите продукт ПЦР из геля, экстрагировав ДНК с помощью набора для экстракции геля в соответствии с инструкциями производителя. Храните извлеченные образцы при температуре -20 градусов Цельсия.