Окрашивание живых/мертвых для количественного определения жизнеспособных, но не поддающихся культивированию клеток ранообразующих бактерий, обработанных медом манука

Этот исследовательский проект направлен на изучение влияния меда манука на физиологию бактерий. Недавние исследования позволили получить дополнительное представление об антимикробном воздействии меда манука на физиологию бактерий. Наши предварительные результаты показывают, что медоносные бактерии манука переходят в устойчивую к антибиотикам, жизнеспособную, но не поддающуюся культивированию состояние покоя, но в меньшей степени, чем те, которые лечатся обычными антибиотиками.

Основываясь на наших экспериментах, было бы интересно сравнить профили экспрессии меда манука и обычных антибиотик-индуцированных VBNC. Для начала возьмите флаконы, содержащие замороженные штаммы бактерий. Откройте каждую из них последовательно и с помощью стерильной палочки соскребите небольшое количество замороженных бактерий на агаровую пластину с соответствующей маркировкой Luria-Bertani или LB.

Установите на место крышку флакона и быстро поместите его в морозильную камеру. Инкубируйте бактериальные культуры в течение 18–24 часов при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день с помощью серологической пипетки переведите два миллилитра бульона LB в две стерильные пробирки.

Стерилизуйте инокуляционный контур в пламени горелки Бунзена. Затем перенесите четверть петли бактерий из агаровой пластины LB в пробирку с соответствующей маркировкой, содержащую бульон LB. Инкубируйте пробирку в аэробных условиях в встряхивающем инкубаторе со скоростью около 250 об/мин при 37 градусах Цельсия в течение 18–24 часов.

Для приготовления меда манука и лечения бактерий антибиотиками добавьте 10 микролитров бактериальной культуры в 10 миллилитров бульона Мюллера-Хинтона, чтобы получить разведение бактериальной культуры в соотношении 1:1 000, которая имеет примерно от 10 до шестой колониеобразующих единиц на миллилитр. Используйте разведенные культуры для подготовки трех образцов для каждого вида бактерий: необработанного контроля, образца, обработанного медом манука, и образца, обработанного антибиотиками. Добавьте мед манука и антибиотик в соответствующие пробирки.

Перенесите 0,1 мл и 0,5 мл необработанного образца в стерильные микроцентрифужные пробирки для определения жизнеспособного количества планшетов и окрашивания живых/мертвых образцов T равно нулю. Затем инкубируйте необработанный контроль, обработанный медом манука и обработанные антибиотиками образцы в аэробных условиях при 37 градусах Цельсия в трясущемся инкубаторе при 250 оборотах в минуту в течение 24 часов. Приготовьте десятикратное серийное разведение T равно нулю необработанного образца в бульоне LB, чтобы получить счетное количество клеток для жизнеспособного подсчета планшетов.

Распределите по 50 микролитров каждого разведенного образца на одну половину агаровой пластины LB. Инкубируйте агаровые пластины в аэробных условиях при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. На следующий день извлеките агаровые пластины LB из инкубатора.

Определите разбавляющую пластину, содержащую примерно от 25 до 150 колоний, и подсчитайте точное количество колоний. Используйте формулу колониеобразующей единицы для определения количества культивируемых клеток на миллилитр. На третий день добавьте 0,5 миллилитра 0,85% хлорида натрия к 0,5 миллилитра тестостерона, что равно нулю необработанного контрольного образца для живых/мертвых животных.

Соедините 1,5 микролитра SYTO 9 и 1,5 микролитра йодида пропидиума на образец. Затем добавьте по три микролитра смеси к каждой пробе. Инкубируйте образцы при температуре 21 градус Цельсия в темноте в течение 15 минут.

Перенесите шесть микролитров окрашенного, аккуратно перемешанного образца в одноразовый гемоцитометр и посмотрите под флуоресцентным микроскопом с помощью флуоресцеина изотиоцианата или фильтра FITC и объектива с 40-кратным увеличением. Сделайте снимок, показывающий как линии сетки гемоцитометра, так и зеленые клетки. Подсчитайте зеленые ячейки в шести полях для каждого образца, отмечая размеры сетки, чтобы вычислить количество зеленых ячеек на том.

Наконец, рассчитайте количество жизнеспособных, но не поддающихся культивированию клеток, вычитая количество культивируемых клеток на миллилитр, полученное с использованием подсчета жизнеспособных пластин, из числа жизнеспособных клеток на миллилитр, полученного с помощью окрашивания живыми/мертвыми. На четвертый день, после удаления необработанных, обработанных медом манука и обработанных антибиотиками бактериальных культур из инкубатора, соберите 0,1 миллилитра и 0,5 миллилитров каждого образца в микроцентрифужные пробирки для подсчета жизнеспособных планшетов и окрашивания живых/мертвых. На этом рисунке показано количество культивируемых и жизнеспособных клеток, определенное с использованием подсчета жизнеспособных пластин и окрашивания живых/мертвых для культур S.aureus и P.aeruginosa.

Результаты показывают, что количество жизнеспособных и культивируемых клеток, обнаруженных в необработанных культурах и культурах, обработанных медом манука, существенно не отличалось. В культурах S.aureus, обработанных тобрамицином, было меньше культивируемых клеток, чем жизнеспособных, но эта разница не была существенной. Только обработанный меропенемом P.aeruginosa показал статистически значимое снижение культивируемых клеток по сравнению с жизнеспособными клетками.