Разработка химерных антигенных рецепторов-естественных киллеров, нацеленных на грибковые инфекции с использованием невирусной транспозонной системы Sleeping Beauty

Наши исследования сосредоточены на разработке готовой клеточной терапии CAR для инвазивных грибковых инфекций. Мы стремимся определить наилучшие мишени, конструкции CAR и комбинацию иммунных клеток для достижения оптимальных терапевтических результатов. Последние разработки, в том числе и наши собственные работы, были сосредоточены на разработке CAR T-клеточной терапии, нацеленной на Aspergillus fumigatus.

Эти сконструированные клетки показали многообещающие результаты в доклинических моделях, значительно снижая грибковую нагрузку, контролируя противогрибковый иммунитет и улучшая общую выживаемость. В настоящее время большинство исследований в этой области сосредоточено на производстве CAR T-клеток, специфичных для очень ограниченного набора мишеней, с использованием вирусных векторов или транспозонной системы спящей красавицы. Основные проблемы связаны с определением оптимальных мишеней для грибков и созданием готового к использованию клеточного продукта, который был бы одновременно эффективным и масштабируемым для клинического применения.

С помощью этого протокола мы удовлетворяем потребность в экономически эффективных и масштабируемых методах создания невирусных CAR-NK-клеток. Он обеспечивает доступный подход к скринингу новых противогрибковых мишеней, обеспечивая фундаментальный шаг на пути к готовой клеточной терапии CAR-NK грибковых инфекций. Для начала проверьте клетки NK-92 под микроскопом на наличие кластеров на чистом фоне, добавьте 2 миллилитра среды для клеточных культур на лунку для каждого условия в шестилуночный планшет и поместите планшет во увлажненный инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа.

Переведите 8 умножить на 10 в мощность 6 ячеек НК-92 в коническую донную трубку объемом 15 миллилитров и центрифугировать пробирку при 200 G в течение пяти минут с ускорением и замедлением 3. После удаления надосадочной жидкости заполните пробирку, содержащую клеточную гранулу, до 15 миллилитров предварительно подогретого PBS и снова запустите центрифугу. Во время центрифугирования пипеткой нанесите 8 микрограммов плазмидной ДНК Af-CAR и 4 микрограмма мини-ДНК SB100X в одну реакционную пробирку и оставьте ДНК второй пробирки свободной, чтобы она служила имитацией контроля.

Для трансфекционной системы добавьте 3 миллилитра электролитического буфера в первую пробирку и поместите ее в станцию дозатора. После центрифугирования аккуратно выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 200 микролитрах буфера для ресуспензии. Затем добавьте по 100 микролитров клеточной суспензии в каждую из двух реакционных пробирок и аккуратно перемешайте.

Пипетируйте смесь клеток ДНК из первой реакционной пробирки с помощью пипетки трансфекционной системы, вставьте трансфекционную пипетку вертикально в пробирку в пипетной станции. Установите первый импульс на 1 650 вольт и время импульса в течение 20 миллисекунд перед нажатием кнопки Start, чтобы инициировать импульс. После первого импульса установите второй импульс на 500 вольт и время импульса на 100 миллисекунд и инициируйте второй импульс.

После завершения второго импульса медленно извлеките пипетку из пипеточной станции. Немедленно перенесите клетки в одну лунку подготовленной культуральной пластины, содержащую 2 миллилитра предварительно подогретой среды для культивирования клеток, и аккуратно переместите пластину круговыми движениями для равномерного распределения клеток. Инкубируйте планшет во влажном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом.

После 30 минут инкубации добавьте в лунки интерлейкин-2 в конечной концентрации 150 международных единиц на миллилитр. Для начала трансфицируйте клетки NK-92 нужной плазмидой. Переложите клетки в коническую нижнюю трубку объемом 15 миллилитров.

Затем центрифугируют клетки и разбавляют их до концентрации от 1 до 2 раз по 10 в степени 6 клеток на 100 микролитров с помощью буфера. Добавьте один микролитр анти-EGFR-T биотина на 1 умножить на 10 в 6 клетках и аккуратно перемешайте, чтобы раствор равномерно распределился. Инкубируйте пробирку в течение 25 минут при температуре 4 градуса Цельсия.

После инкубации заполните пробирку до 10 миллилитров буфера. Далее центрифугируйте пробирку при 200 G в течение пяти минут с ускорением и замедлением 3, а после центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость. Затем добавьте 8 микролитров холодного буфера, а затем два микролитра антибиотиновых магнитных шариков из расчета 1 умножить на 10 в объеме 6 клеток.

Инкубируйте пробирку в течение 15 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Чтобы промыть клетки, заполните пробирку до 10 миллилитров буфера и центрифуги. После выброса надосадочной жидкости повторно суспендируйте клетки в 500 микролитрах буфера.

Поместите колонку LS в магнит max и промойте ее 3 миллилитрами буфера. Добавьте суспензию ячеек после того, как буфер полностью пройдет через столбец. После мытья колонки снимите ее с магнита и поместите в чистую трубку с коническим дном объемом 15 миллилитров.

Добавьте в колонку 5 миллилитров буфера и с помощью поршня как можно быстрее вымойте положительные ячейки EGF-R. Эффективность трансфекции после восстановления достигла от 10 до 20%, а максимальное обогащение увеличило чистоту клеток Af-CAR-NK-92 до более чем 95%Для начала необходимо получить обогащенные трансген-экспрессирующие NK-92 клетки с использованием метода магнитно-активированной сортировки клеток. Затем приготовьте суспензию Aspergillus fumigatus conidia в концентрации 2,5 раза по 10 в размере 5 конидий на миллилитр в среде.

Дозируйте 100 микролитров суспензии конидий в каждую лунку 96-луночного планшета для культивирования и инкубируйте планшет при температуре 25 градусов Цельсия в течение 16 часов. На второй день дважды промойте этим средством фиктивные и трансфицированные плазмидами клетки NK-92 и добавьте 5 раз по 10 в объеме 4 клеток NK-92 в 100 микролитрах среды на лунку планшета, содержащего гриб, для совместного культивирования. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с увлажненным углекислым газом не менее 6 часов.

После центрифугирования планшета при 300 G в течение пяти минут соберите по 100 микролитров надосадочной жидкости из каждой лунки, не касаясь дна. Наконец, перенесите надосадочную жидкость в реакционные пробирки для проведения ИФА. Клетки Af-CAR-NK-92 показали значительно более высокую секрецию интерферона гамма по сравнению с фиктивными клетками NK-92 во время совместного культивирования с зародышевыми трубками aspergillus fumigatus.