Изготовление и маркировка микропузырьков с помощью флуоресцентных и радиоактивных индикаторов

Микропузырьки — это заполненные газом чувствительные к ультразвуку частицы с уникальными возможностями визуализации и терапии рака. Их развивающиеся утилиты могут быть стратегически усовершенствованы за счет создания отслеживаемых микропузырей, управляемых приложениями. Мы стремимся облегчить достижение этой цели, разработав протокол изготовления липидных микропузырьков, который позволяет настраивать генерацию немеченных, радиоактивно меченных, флуоресцентных и мультимодальных микропузырьков.

Достижение эффективной и стабильной микропузырьковой радиомаркировки является нетривиальной задачей. Липидные микропузырьки хрупкие, и поэтому их воздействие на нагревание, время и этапы очистки в подходах к радиомаркировке после изготовления может нарушить их физико-химические свойства и стабильность. С другой стороны, предварительная радиомаркировка требует специализированного оборудования и повышенной радиационной нагрузки.

Мы преодолели эти проблемы, разработав новый гибридный протокол, в котором хелатирование радиоизотопов происходит до активации микропузырьков, но после образования липидной суспензии. Этот подход с использованием одного котла впервые обеспечивает высокоэффективное микропузырьковое радиомечение без очистки, которое сохраняет физико-химические свойства частиц. Ключевым дополнительным преимуществом является универсальность протоколов. Он может быть включен во время изготовления микропузырьков на заказ и адаптирован к предварительно сформированным липидным суспензиям микропузырьков, таким как те, которые доступны в продаже. Он может быть успешно применен к различным липидным и хелаторным композициям микропузырьков и, соответственно, может генерировать специализированные радиоактивные, флуоресцентные или тримодальные микропузырьки.

В совокупности эти свойства позволяют проводить мультимодальную репрезентативную трассировку липидных оболочек микропузырьков, что может способствовать развитию механистической диагностики и поддержки ультразвуковой терапии, сфокусированной на микропузырьках, во многих областях, включая фармакокинетическое исследование микропузырьков, мультимодальную визуализацию, планирование лечения и обеспечение синергетической терапии.

[Рассказчик] Чтобы начать использовать микропипетку, добавьте один миллилитр раствора AA-PGG по краям выбранной липидной пленки микропузырьков во флаконе, избегая образования пузырьков. Частично закройте отверстие флакона крышкой, оставив достаточно места для вставки линии перфторпентана или PFP. Налейте PFP в свободное пространство флакона на 20 секунд над жидкостью и закройте флакон крышкой. Погрузите нижнюю половину флакона в водяную баню при температуре от 70 до 80 градусов Цельсия на одну минуту. Затем обработайте флакон ультразвуком в течение 30 секунд в ванне с помощью ультразвукового аппарата при температуре 69 градусов Цельсия. После обработки ультразвуком протрите флакон и дайте ему остыть до комнатной температуры. Наполните свободное пространство флакона газом PFP. Затем закройте флакон крышкой и заклейте края парапленкой. Чтобы установить водяную баню с температурой 60 градусов Цельсия в кристаллизующейся чашке, поместите в чашку магнитную мешалку и поместите ее на горячую пластину для перемешивания с регулируемой температурой. Вставьте в воду термозонд, чтобы контролировать температуру и отрегулировать скорость перемешивания, чтобы создать слабую, но заметную воронку. С помощью щипцов перенесите герметичный флакон, содержащий медь 64 в виде хлорида меди в 0,1 нормальной соляной кислоты, в калибратор дозы. Запишите активность меди 64 и время. С помощью щипцов извлеките флакон из калибратора дозы и поместите его в емкость со свинцом. Чтобы рассчитать значение в мегабеккерелях на миллилитр, разделите активность, отмеченную на калибраторе дозы, на объем меди 64. Снимите липидную суспензию и закрепите ее в держателе флакона. Затем откупорьте флакон из меди 64, обрабатывая флакон щипцами. С помощью микропипетки передают объем раствора меди 64, соответствующий от 40 до 250 мегабеккерелей активности, в липидную суспензию. Используя щипцы с плоским резиновым наконечником, вращайте радиоактивную липидную суспензию вверх и вниз не менее пяти раз, чтобы смешать медь 64 с суспензией. Пока флакон находится правой стороной вверх, осторожно вздерните крышку, стабилизируя флакон. Осторожно, частично откупорьте флакон и вставьте иглу, оборудованную линией PFP. Заполните свободное пространство флакона PFP на 20 секунд. Затем закупорьте флакон и запечатайте парапленкой. Измерьте активность флакона с помощью калибратора дозы и запишите время. Далее поместите флакон в держатель флакона из пенопласта так, чтобы нижняя половина флакона подвергалась воздействию тепла. Погрузите держатель в помешивающую водяную баню при температуре 60 градусов Цельсия и нагрейте на один час. Тем временем, чтобы приготовить полоски iTLC, разрежьте стеклянную бумагу для хроматографии из микрофибры на полоски. Нагрейте полоски в стеклянной сушильной печи при температуре 80 градусов Цельсия для активации. Через час снимите флакон с водяной бани и протрите его края папиросной бумагой. Вращайте флакон вверх и вниз с помощью щипцов с резиновым наконечником. Пока флакон находится в вертикальном положении, задерните крышку, стабилизируя флакон. Снимите парапленку и протрите крышку, чтобы удалить попавшую воду. Найдите один-два микролитра липидной суспензии в одном сантиметре от центра нижней части активированной полоски iTLC. Дайте пятну высохнуть. С помощью микропипетки добавьте 200 микролитров элюента iTLC на дно пробирки объемом 10 миллилитров. Поместите трубку в свинцовый контейнер. Добавьте пятнистую полоску iTLC в пробирку и дайте ей проявиться, пока элюент не достигнет примерно одного сантиметра от верхней части полоски. Далее с помощью щипцов извлеките проявленную полоску и удерживайте ее вертикально. Разрежьте полоску на три части по гамма-счетчику, совместимым с пятимиллилитровыми пластиковыми трубками. Вставьте в пробирки нажимные колпачки. Измерьте полоску, содержащую трубки и пустую контрольную трубку, с помощью гамма-счетчика для обнаружения активности меди 64. Запишите количество отсчетов в минуту и вычтите активность контрольной трубки из других показаний для коррекции фонового излучения. Затем рассчитайте радиохимическую чистоту на основе скорректированных подсчетов в минуту. Затем откройте флакон с липидной суспензией, помеченный радиоизлучением, и добавьте в суспензию 8,89 микролитров одного нормального гидроксида натрия. После укупорки и вращения флакона осторожно постучите по флакону, чтобы удалить застрявшую взвесь в пространстве крышки и заполнить верхнее пространство газом PFP. Поместите флакон на механический шейкер и активируйте его на 45 секунд при 4 530 об/мин, чтобы получить молочную суспензию микропузырьков. После пассивного охлаждения до комнатной температуры осторожно переверните флакон, чтобы снова суспендировать микропузырьковую суспензию. Установите флакон на ровную поверхность и подождите две минуты. Тем временем оснастите пластиковый шприц объемом один миллилитр иглой 18 калибра и продуйте шприц, втягивая и вдыхая воздух внутрь и наружу. Через две минуты быстро откройте флакон и наберите от 400 до 550 микролитров суспензии со дна флакона. Осторожно протрите края иглы и переложите микропузырьковую суспензию в микроцентрифужную пробирку. После укупорки пробирки измерьте активность конечного продукта микропузырьков на калибраторе дозы и запишите время. Разделите значение активности на декантированный объем, чтобы получить активность в мегабеккерелях на миллилитр. Для начала добавьте от 10 до 200 микролитров микропузырьковой суспензии в фильтрующий блок центрифуги объемом 0,5 миллилитра с отсечкой по молекулярной массе 30 000 в совместимой микроцентрифужной пробирке. Центрифугируйте суспензию при 12 000 G в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем с помощью ножниц разрежьте соединение между микроцентрифужной пробиркой и ее крышкой. Поместите крышку в сцинтилляционный флакон объемом 20 миллилитров с маркировкой CAPS. Переложите фильтрующий блок в новую микроцентрифужную пробирку с маркировкой TUBE 2. Поместите первую микроцентрифужную пробирку, содержащую инфранатант, в 20-миллилитровый сцинтилляционный флакон с надписью TUBE 1. Добавьте 200 микролитров дважды дистиллированной воды в фильтрующий блок в TUBE 2. Снова центрифугируйте фильтрующий блок при 12 000 G в течение 10 минут. После последнего переноса фильтрующего блока добавьте 200 микролитров дистиллированной воды в фильтрующий блок в TUBE 3 и центрифугируйте. После центрифугирования разрежьте крышку пробирки, добавив ее в колпачок сцинтилляционного флакона, и переложите фильтрующий блок в новый 20-миллилитровый сцинтилляционный флакон с маркировкой UNIT. Поместите TUBE 3 в новый стеклянный сцинтилляционный флакон объемом 20 миллилитров. Закупорьте пять сцинтилляционных флаконов и приготовьте одну пустую и закрытую сцинтилляционную пробирку в качестве пустого контроля. Измерьте шесть сцинтилляционных флаконов на гамма-счетчике, чтобы обнаружить активность меди 64. Вычтите контрольную заготовку из других измерений флакона. Рассчитайте эффективность радиомаркировки или хелатирования.