Респирометрия высокого разрешения в камере малого объема
25 июля 2025 г.
Здесь мы показываем, что камера объемом 0,5 мл для респирометрии с высоким разрешением показывает результаты, которые согласуются с камерой объемом 2,0 мл, если применяется соответствующая инструментальная коррекция фонаО2. Для этого требуется меньше образца, что выгодно для исследований с ограниченной доступностью или низкой дыхательной способностью.
В этом исследовании мы хотим выяснить, можно ли использовать камеру малого объема, откалиброванную до 0,5 миллилитров, в респирометрических анализах без ущерба для точности, полученной для двух миллилитров классического объема на платформе Oroboros.
Наша разработка камеры малого объема и оценка с помощью респирометрии высокого разрешения со строгим контролем качества с использованием прецизионного анализа OXPHOS проложили путь к разработкам, новым инновациям, а именно, во-первых, 12-камерному респирометру O2k, во-вторых, роботу для автоматического титрования веществ в сложных протоколах, применяемых для анализа OXPHOS. Эти приложения будут иметь решающее значение для дальнейшего расширения митохондриальной аналитики, диагностики митохондриальных заболеваний, оценки разработок лекарств, уделяя особое внимание как преимуществам лекарств для митохондриальной функции, так и побочным эффектам, которые непроизвольно нарушают функцию митохондрий. Когда моя команда разрабатывала респирометрию высокого разрешения более 30 лет назад, существовала парадигма, что митохондрии, митохондрии, митохондрии. Может быть, и была разница между митохондриями мышц и печени, но на этом все. Никто на самом деле не интересовался митохондриями вне этих парадигм. С помощью наших протоколов, разработанных для респирометрии с высоким разрешением, мы продемонстрировали огромное разнообразие функций митохондрий. Это позволяет нам оценить контроль митохондриального дыхания в различных типах клеток, тканях и видах с помощью нового глаза. За 30 лет назад было около 10 изданий, которые это оценили. Теперь у нас есть более 1500 человек, использующих эти протоколы.
В камере малого объема требуется в четыре раза меньше образца по сравнению с классической двухмиллилитровой камерой. В случае образца с низкой частотой дыхания такое же количество образца может быть использовано для увеличения объемных удельных потоков кислорода для снижения погрешности измерения.
Основное внимание в нашей работе в научно-исследовательской лаборатории «Ороборос» уделяется объединению инструментальных разработок и академических исследований. Мы оцениваем митохондриальную дыхательную функцию и биогенетические профили с помощью мультисенсорного анализа. Это измерение дыхания, окислительно-восстановительного потенциала, мембранного потенциала, поглощения кальция, производства перекиси водорода и различных других параметров, которые позволяют нам глубже понять биогенетический профиль, функцию и дисфункцию митохондрий.
[Рассказчик] Для начала установите Малый Объем, или камеру SV, на Oroboros. Затем включите Oroboros и нажмите Connect, чтобы подключить Oroboros к программному обеспечению DatLab. После полного высыхания камер с помощью пипетки добавьте 0,54 миллилитра воды в камеру SV. Затем включите мешалки. Перед закрытием камеры увлажните уплотнительные кольца стопоров, сохраняя капилляр сухим. Ослабьте кольцо калибровки объема, затем вставьте пробку вниз до тех пор, пока жидкость не заполнит капилляр пробки и в емкости на верхнем конце капилляра не образуется мениск. Затяните кольцо калибровки объема, чтобы зафиксировать его положение, обеспечивая постоянство откалиброванного объема при последовательных введениях. Для начала заполните камеры дыхательной средой MiR05 Запустите программное обеспечение DatLab. Выберите подходящий протокол для инструментального фонового теста. Установите скорость вращения мешалки равной 550 об/мин, объем камеры — 0,5 миллилитров, интервал записи данных — две секунды, а экспериментальную температуру — 37 градусов Цельсия. Проведите тест мешалки и калибровку воздуха. Установите отметку R1 на графике концентрации кислорода, перемещая курсор, удерживая клавишу Shift. Время от времени проводите калибровку без содержания кислорода. Во время воздушной калибровки приготовьте свежий стоковый раствор дитионита натрия, растворив порошок O2-Zero в 50 миллимолярном фосфатном буфере до концентрации 2,5 миллимоль для SV. После завершения воздушной калибровки закройте камеру. Контролируйте сигнал кислорода в течение примерно 60–120 минут, позволяя концентрации кислорода снижаться с насыщения воздуха примерно до 150 микромоляров. Установите четыре метки с пометками от J01 до J04 на графике отрицательного наклона кислорода. По желанию, с помощью шприца Гамильтона, титруют раствор дитионита натрия, чтобы довести концентрацию кислорода до 100 микромоляров и установить отметку J05. Чтобы рассчитать инструментальный наклон фона кислорода в DatLab, выберите Flux Slope. Затем откройте окно коррекции фона кислорода и выберите Active file в качестве источника данных о фоновом сигнале кислорода. Убедитесь, что для расчета линейной регрессии используются все отметки J0. Затем нажмите «Применить для коррекции кислородного фона». Для начала промойте камеры Oroboros деионизированной водой и добавьте в камеру свежую среду MiR05. После инструментального фонового теста откройте новую вкладку DatLab и выберите протокол SUIT-003 для экспериментов с тромбоцитами человека. Используя обзор протокола DatLab, который отображается на боковой панели «Протокол», выберите исходные решения для химических веществ. Затем выберите шприцы Hamilton в соответствии с химическими веществами. Поместите шприцы на штатив для шприцев с этикетками в последовательности согласно протоколу SUIT. Для частичного замещения объема рассчитайте объем V в эквиваленте объема V, удаленного из фактического объема в открытой камере, с учетом мертвого объема капилляров. Затем снимите полностью вставленную пробку и положите ее на стойку. Выведите рассчитанный объем V из MiR05 из камеры в зависимости от типа ячейки и концентрации суспензии стоковых клеток. Теперь пипеткой направьте в камеру эквивалентный объем суспензии стоковых клеток с известной концентрацией клеток. Напротив, для полного восполнения объема откачайте всю среду из камеры. Добавьте в камеру СО 0,54 миллилитра запаса изолированных митохондрий сердца. Закройте камеру и откачайте излишки раствора из пробного сосуда. Чтобы запустить протокол титрования ингибитора развязки субстрата (SUIT), откройте окно «Событие» в DatLab для визуализации объемов титрования. С помощью микрошприца Hamilton титруйте исходные растворы химических веществ в камеру. Затем установите событие в DatLab. Обеспечьте стабилизацию флюса после титрования. Для анализа данных установите отметку на репрезентативной и стабильной части графика. Фоновый поток кислорода при насыщении воздухом был в 3,9 раза выше в камере объемом 0,5 миллилитра по сравнению с камерой объемом 2,0 миллилитров, что согласуется с теоретически ожидаемой четырехкратной разницей в объемном фоновом потоке кислорода. Вариабельность инструментальных фоновых потоков была практически одинаковой в двух камерных объемах. Частота дыхания живых тромбоцитов, пермеабилизированных фибробластов и изолированных митохондрий тесно коррелировала в обоих типах камер при применении соответствующей коррекции фона. Поток кислорода стабилизировался быстрее в двухмиллилитровой камере, чем в 0,5-миллилитровой камере после реоксигенации. Потребление остаточного кислорода после ингибирования комплекса III было стабильным между двумя камерами, что соответствовало инструментальному пределу обнаружения.
Обзор
В данном исследовании изучается возможность применения камеры объемом 0.5-mL для респирометрии высокого разрешения по сравнению с традиционной камерой объемом 2.0-mL. Результаты показывают, что при надлежащей коррекции фонового сигнала прибора меньшая камера обеспечивает точные измерения при меньшем объеме образца, что является преимуществом для исследований с ограниченным количеством доступного материала.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Респирометрия высокого разрешения
- Анализ функции митохондрий
- Измерение потребления кислорода
Теоретическая база
- Необходимость в эффективных экспериментальных подходах в исследованиях митохондрий
- Традиционное использование более крупных камер ограничивает объем образца
- Перспективные технологии, расширяющие возможности анализа митохондрий
Используемые методы
- Сравнение респирометрических камер объемом 0.5 mL и 2.0 mL
- Исследования митохондриального дыхания
- Прецизионный анализ OXPHOS для контроля качества
Основные результаты
- Для камеры объемом 0.5-mL требуется в четыре раза меньший объем образца
- Стабильная точность, подтвержденная в ходе строгой валидации
- Расширение возможностей применения в диагностике митохондриальных заболеваний и разработке лекарственных препаратов
Выводы
- Исследование определяет камеру объемом 0.5-mL как надежную альтернативу для изучения митохондрий
- Актуальность подчеркивает прогресс в технологии респирометрии и ее значение для биологических исследований
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Респирометрия высокого разрешения в камере объемом 0,5 mL позволяет проводить точный анализ митохондриальной функции при минимальных требованиях к количеству образца, что напрямую решает проблемы раннего поиска и трансляционных исследований, где доступность образцов ограничена. Данная возможность повышает прогностическую достоверность при изучении метаболических путей и поддерживает принятие взвешенных с учетом рисков решений по портфелю за счет обеспечения получения надежных данных из дефицитных или малоактивных с точки зрения дыхания биологических материалов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Позволяет проводить тщательный анализ митохондриальной функции в различных типах клеток и тканей при ограниченном количестве исходного материала.
- Способствует снижению биологических рисков, обеспечивая высокоточные измерения респираторного потока для функциональной валидации мишеней.
- Повышает прогностическую достоверность анализа метаболических путей, что позволяет принимать обоснованные решения о целесообразности дальнейшего исследования на ранних этапах.
Скрининг и разработка методов анализа
- Подготовка валидированных митохондриальных анализов для последующего скрининга соединений с воспроизводимыми количественными результатами.
- Стандартизация условий анализа за счет точной коррекции фона и оптимизации скорости перемешивания.
- Обеспечение масштабируемого высокопроизводительного скрининга за счет снижения требований к объему образцов и повышения гибкости платформы.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет показатели митохондриального анализа с системами, имеющими отношение к заболеванию, для поиска трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации за счет поддержки надежных механистических исследований на ограниченном количестве образцов.
- Снижает риски при принятии решений о дальнейшем продвижении разработки, предоставляя достоверные функциональные данные в моделях с низкой дыхательной способностью.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Этот метод респирометрии малого объема интегрируется на всех этапах — от начального поиска до идентификации ведущих соединений и доклинических исследований, обеспечивая согласованность митохондриального анализа на протяжении всего цикла НИОКР.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез и уточнение путей в исследованиях метаболизма и митохондрий.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные измерения потока кислорода для подготовки анализа и оценки соединений.
- Аналитика: предоставляет данные дыхания с высоким разрешением и коррекцией фона для надежного статистического сравнения экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: способствует согласованию биомаркеров и снижению рисков при изучении механизмов в моделях соответствующих заболеваний.
- Корпоративное использование: предлагает многоразовую стандартизированную платформу для изучения функций митохондрий в различных программах НИОКР.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации митохондриальных мишеней.
- Операционная ценность: Повышает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость респирометрических анализов.
- Стратегическая ценность: Улучшает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет получения достоверных данных из минимального количества образцов.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию с учетом рисков и продвижение метаболических и митохондриальных мишеней.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области анализа митохондрий и протоколов респирометрии высокого разрешения.
- Необходим доступ к прецизионному оборудованию и многосенсорной аналитической инфраструктуре.
- Требуется строгая стандартизация между группами исследователей для коррекции фона и калибровки анализа.
- Метод адаптируем к различным типам клеток и тканей при соответствующей корректировке протокола.
- Фоновый поток прибора выше в малых камерах, но остается воспроизводимым и поддающимся коррекции.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
3:23
Volume Calibration of the Oroboros Chamber for High-Resolution Respirometry Analysis
4:25
Air Calibration and Instrumental Oxygen Background Testing for High-Resolution Respirometry Analysis
6:40
Analysis of Oxygen Consumption in the Oroboros Chambers Using Substrate-Uncoupler-Inhibitor Titration
