Скрининг in vitro на основе светодиодов для оценки фотоактивируемых молекул при бактериальной фотодинамической инактивации

Мои исследования сосредоточены на изучении различных молекул из семейства соединений флавилия, как природных, так и синтетических, с основным интересом к изучению их биологической активности в контексте УФ-фотозащиты и оценке их потенциала в качестве фотосенсибилизаторов для применения в фотодинамической терапии. Недавние результаты, полученные в нашей исследовательской группе, продемонстрировали светоактивируемые свойства флавилиевых красителей на основе аминов, что сделало их новым перспективным классом фотосенсибилизаторов. Эти соединения демонстрируют значительный потенциал для дальнейших исследований, прокладывая путь к инновационным приложениям в этой области.

Используя 96-луночную систему микропланшетов и световых панелей, мы можем получить высокопроизводительный скрининг фотосенсибилизаторов в контролируемой среде, что упрощает идентификацию и сравнение различных кандидатов на фотодинамическую терапию. Для начала внесите бактерии Staphylococcus aureus на агаровую пластину Мюллера-Хинтона из стоп-культуры. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов для получения свежей культуры.

Соберите две-три свежие колонии из агаровой пластины и разведите их в шести миллилитрах предварительно подогретого стерильного отфильтрованного PBS при pH 7,4. Вортексируйте инокулюм со скоростью 1200 оборотов в минуту в течение трех-четырех циклов для гомогенизации образца и извлечения трех миллилитров гомогенизированного инокулюма в одноразовую кювету. После измерения оптической плотности на 600 нанометрах разбавьте образец до оптической плотности 0,1 с помощью PBS.

Приготовьте исходный раствор фотосенсибилизирующего соединения в соответствующем растворителе, таком как ДМСО или ПБС. Разбавьте стоковый раствор в PBS для получения рабочего раствора, следя за тем, чтобы компоненты бактериальной питательной среды не препятствовали поглощению света. Vortex - рабочий раствор для обеспечения полной гомогенизации.

Для начала приготовьте суспензию золотистого стафилококка и рабочий раствор фотосенсибилизатора. Подготовьте два отдельных 96-луночных планшета, один из которых предназначен для воздействия света, а другой - для контроля темноты. В каждую пластину нанесите по 100 микролитров раствора фотосенсибилизатора и бактериальной суспензии.

Смешайте растворы от 5 до 10 раз с помощью пипетки. Инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут, чтобы фотосенсибилизатор взаимодействовал с бактериальными клетками. После инкубации извлеките пластины из инкубатора.

Держите одну из пластин в защищенном от воздействия света в качестве регулятора темноты. Поместите другую 96-луночную пластину над прямоугольной светодиодной панелью мощностью 50 Вт. Отметьте края пластины на поверхности светодиода, чтобы обеспечить равномерное размещение при повторении протокола.

Подвергайте пластину воздействию светодиодного света примерно на 15 минут. Используйте другую 96-луночную пластину для приготовления серийных разведений образцов, включая контрольные, необлученные и облученные лунки. Добавьте 180 микролитров PBS в каждую лунку, в соответствии с количеством проб.

Распределите по 20 микролитров из каждой лунки в облученные и необлученные пластины в первую колонну заполненной ПБС пластины. С помощью многоканального микропипетки выполнить простое серийное разведение от лунки 1 до 6. Разделите агаровую пластину на шесть равных частей, каждая из которых соответствует одному из разведений.

Аликвотируйте по 10 микролитров из каждой лунки на соответствующий участок агаровой пластины. Выдерживайте тарелку от 18 до 20 часов. Извлеките агаровую пластину из инкубатора и определите участки, подходящие для подсчета колонии.

В каждой секции пластины шнека подсчитайте количество колониеобразующих единиц. Спектр видимого света показал три отчетливых пика между 400 и 700 нанометрами. В темных условиях ни одно из испытуемых соединений флавилия не показало цитотоксических эффектов.

Напротив, после воздействия света испытуемые соединения вызывали дозозависимое снижение жизнеспособности золотистого стафилококка со значительными эффектами, наблюдаемыми при концентрациях 6 и 12 микромоляров.