Скрининг in vitro на основе светодиодов для оценки фотоактивируемых молекул при бактериальной фотодинамической инактивации
24 января 2025 г.
Этот протокол описывает простой и экономичный метод оценки эффективности потенциальных фотосенсибилизаторов в антибактериальной фотодинамической инактивации (aPDI) с использованием 96-луночного планшета в сочетании с источником света на светодиодной панели. Этот подход позволяет одновременно тестировать несколько экспериментальных условий, включая различные концентрации, соединения и штаммы бактерий.
Мои исследования сосредоточены на изучении различных молекул из семейства соединений флавилия, как природных, так и синтетических, с основным интересом к изучению их биологической активности в контексте УФ-фотозащиты и оценке их потенциала в качестве фотосенсибилизаторов для применения в фотодинамической терапии. Недавние результаты, полученные в нашей исследовательской группе, продемонстрировали светоактивируемые свойства флавилиевых красителей на основе аминов, что сделало их новым перспективным классом фотосенсибилизаторов. Эти соединения демонстрируют значительный потенциал для дальнейших исследований, прокладывая путь к инновационным приложениям в этой области.
Используя 96-луночную систему микропланшетов и световых панелей, мы можем получить высокопроизводительный скрининг фотосенсибилизаторов в контролируемой среде, что упрощает идентификацию и сравнение различных кандидатов на фотодинамическую терапию. Для начала внесите бактерии Staphylococcus aureus на агаровую пластину Мюллера-Хинтона из стоп-культуры. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов для получения свежей культуры.
Соберите две-три свежие колонии из агаровой пластины и разведите их в шести миллилитрах предварительно подогретого стерильного отфильтрованного PBS при pH 7,4. Вортексируйте инокулюм со скоростью 1200 оборотов в минуту в течение трех-четырех циклов для гомогенизации образца и извлечения трех миллилитров гомогенизированного инокулюма в одноразовую кювету. После измерения оптической плотности на 600 нанометрах разбавьте образец до оптической плотности 0,1 с помощью PBS.
Приготовьте исходный раствор фотосенсибилизирующего соединения в соответствующем растворителе, таком как ДМСО или ПБС. Разбавьте стоковый раствор в PBS для получения рабочего раствора, следя за тем, чтобы компоненты бактериальной питательной среды не препятствовали поглощению света. Vortex - рабочий раствор для обеспечения полной гомогенизации.
Для начала приготовьте суспензию золотистого стафилококка и рабочий раствор фотосенсибилизатора. Подготовьте два отдельных 96-луночных планшета, один из которых предназначен для воздействия света, а другой - для контроля темноты. В каждую пластину нанесите по 100 микролитров раствора фотосенсибилизатора и бактериальной суспензии.
Смешайте растворы от 5 до 10 раз с помощью пипетки. Инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут, чтобы фотосенсибилизатор взаимодействовал с бактериальными клетками. После инкубации извлеките пластины из инкубатора.
Держите одну из пластин в защищенном от воздействия света в качестве регулятора темноты. Поместите другую 96-луночную пластину над прямоугольной светодиодной панелью мощностью 50 Вт. Отметьте края пластины на поверхности светодиода, чтобы обеспечить равномерное размещение при повторении протокола.
Подвергайте пластину воздействию светодиодного света примерно на 15 минут. Используйте другую 96-луночную пластину для приготовления серийных разведений образцов, включая контрольные, необлученные и облученные лунки. Добавьте 180 микролитров PBS в каждую лунку, в соответствии с количеством проб.
Распределите по 20 микролитров из каждой лунки в облученные и необлученные пластины в первую колонну заполненной ПБС пластины. С помощью многоканального микропипетки выполнить простое серийное разведение от лунки 1 до 6. Разделите агаровую пластину на шесть равных частей, каждая из которых соответствует одному из разведений.
Аликвотируйте по 10 микролитров из каждой лунки на соответствующий участок агаровой пластины. Выдерживайте тарелку от 18 до 20 часов. Извлеките агаровую пластину из инкубатора и определите участки, подходящие для подсчета колонии.
В каждой секции пластины шнека подсчитайте количество колониеобразующих единиц. Спектр видимого света показал три отчетливых пика между 400 и 700 нанометрами. В темных условиях ни одно из испытуемых соединений флавилия не показало цитотоксических эффектов.
Напротив, после воздействия света испытуемые соединения вызывали дозозависимое снижение жизнеспособности золотистого стафилококка со значительными эффектами, наблюдаемыми при концентрациях 6 и 12 микромоляров.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описан экономичный метод оценки эффективности фотосенсибилизаторов при антибактериальной фотодинамической инактивации (аФДИ) с использованием 96-луночного планшета и светодиодной (LED) панели. Этот метод позволяет одновременно оценивать различные экспериментальные условия, включая разные концентрации, соединения и штаммы бактерий.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биохимия
- Фотодинамическая терапия
Теоретические основы
- Исследования сосредоточены на соединениях флавилия для УФ-фотопротекции.
- Изучение их биологической активности в качестве фотосенсибилизаторов.
- Последние данные подчеркивают потенциал аминосодержащих флавилиевых красителей.
- Высокопроизводительный скрининг упрощает оценку подходящих кандидатов.
Цель исследования
- Оценить эффективность различных фотосенсибилизаторов.
- Выявить перспективные соединения для фотодинамической терапии.
- Углубить понимание механизмов антибактериальной фотодинамической инактивации.
Используемые методы
- Использование 96-луночного микропланшета для тестирования.
- Применение светодиодной панели в качестве источника света.
- Инокуляция Staphylococcus aureus на агар Мюллера-Хинтона.
- Инкубация при 37 °C в течение 24 часов.
Основные результаты
- Идентификация эффективных фотосенсибилизаторов.
- Демонстрация светоактивируемых свойств флавилия красителей.
- Результаты высокопроизводительного скрининга позволяют эффективно сравнивать кандидатов.
- Потенциал для инновационного применения в фотодинамической терапии.
Выводы
- Был разработан простой метод оценки фотосенсибилизаторов.
- Соединения флавилия являются перспективными для дальнейших исследований.
- Данный подход может привести к прогрессу в разработке антибактериальной терапии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Высокопроизводительный in vitro-скрининг на основе светодиодов позволяет быстро оценивать фотоактивируемые молекулы для антибактериальной фотодинамической инактивации, что отвечает актуальным потребностям в условиях антибиотикорезистентности. Эта платформа поддерживает первичный отбор кандидатов в фотосенсибилизаторы, предоставляя стандартизированные, воспроизводимые и количественные данные о жизнеспособности. Интеграция такого скрининга в процессы поиска новых соединений ускоряет идентификацию перспективных молекул для дальнейшей трансляционной разработки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Позволяет систематически оценивать эффективность фотосенсибилизаторов в отношении бактериальных мишеней.
- Обеспечивает биологическую проверку безопасности (de-risking), позволяя отличить светозависимую цитотоксичность от токсичности в темноте.
- Повышает прогностическую уверенность при выборе кандидатов благодаря количественным данным о снижении жизнеспособности.
Скрининг и разработка методов анализа
- Обеспечивает высокопроизводительную стандартизированную оценку нескольких соединений и концентраций параллельно.
- Гарантирует воспроизводимость и сопоставимость результатов между сериями экспериментов за счет использования контролируемого LED-освещения и формата микропланшетов.
- Позволяет получать количественные данные (количество колониеобразующих единиц) для надежного ранжирования соединений и оптимизации анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует целям трансляционного исследования за счет выявления кандидатов с мощной светоактивируемой антибактериальной активностью.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации, позволяя проводить профилирование зависимости «доза-эффект» и селективности.
- Обосновывает решения по продвижению новых противоинфекционных модальностей с учетом оценки рисков.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод скрининга на основе светодиодов (LED) применяется на этапе перехода от предварительного поиска к идентификации перспективных соединений для создания антибактериальных фотодинамических агентов.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез о светоактивируемой цитотоксичности и снижение механистических рисков для молекул-кандидатов.
- Скрининг: обеспечивает готовность и воспроизводимость анализа для масштабируемой оценки соединений.
- Аналитика: позволяет проводить количественное измерение жизнеспособности бактерий и дозозависимых эффектов.
- Трансляционные исследования: связывает этап открытий с доклинической оценкой путем выявления кандидатов с трансляционным потенциалом.
- Корпоративное повторное использование: предоставляет гибкую, многократно используемую платформу, адаптируемую к различным классам фотосенсибилизаторов и штаммам бактерий.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность на ранних этапах поиска противоинфекционных средств.
- Операционная ценность: Стандартизирует рабочие процессы и позволяет проводить воспроизводимые масштабируемые кампании по скринингу.
- Стратегическая ценность: Повышает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет сосредоточения ресурсов на валидированных кандидатах.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение новых модальностей антибактериальных средств.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области микробиологии, фотохимии и разработки количественных методов анализа.
- Необходим доступ к откалиброванным светодиодным (LED) панелям, планшетным ридерам и инфраструктуре для работы в стерильных условиях.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов светового воздействия, работы с планшетами и анализа данных.
- Метод может быть адаптирован для различных бактериальных штаммов и хемотипов фотосенсибилизаторов путем оптимизации протокола.
- Потенциальные ограничения включают растворимость соединений, проникновение света и влияние компонентов среды.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:57
Preparation of Culture and Compounds for Evaluating Photodynamic Activity of Photosensitizers Against Antibiotic-Resistant Bacteria
2:18
In Vitro Photodynamic Inactivation Assay for Bacteria: High-Throughput Testing of Photosensitizers Using LED Illumination
4:37
Representative Results
