Обнаружение аутоантител к MDA5 с использованием клеток HeLa и иммуноцитохимии с помощью световой микроскопии

Основной целью данного эксперимента является использование иммуноцитохимии для скрининга антител к MDA5. Это делается с помощью клеток HeLa, а затем трансфектирует клетку HeLa с помощью конструкции MDA5. Таким образом, клетки HeLa будут продуцировать белки MDA5, которые могут быть присоединены антителами MDA5.

После включения клетки HeLa в конструкцию MDA5 реагент Triton используется для проникновения мембраны клеток HeLa, что позволяет антителам против MDA5 проходить через нее. После этого добавляется сыворотка пациента, содержащая антитела к MDA5. Антитела против MDA5 затем присоединяются к белкам MDA5 внутри клеток HeLa.

После этого вторичные антитела, к которым прикреплена пероксидаза хрена, развертываются в клетках, вторичные антитела затем прикрепляются к антителам против MDA5. Наконец, хромоген добавляется к клеткам и окисляется в присутствии вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, получая видимый цвет под оптическим микроскопом. Положительный результат стояния покажет что-то вроде рисунка выше.

В сегодняшней видеодемонстрации мы переходим к важнейшей области медицинских исследований — обнаружению антител пятого гена, ассоциированных с дифференцировкой меланомы, также называемых антителами против MDA5. Эти аутоантитела играют решающую роль простого диагностического индикатора для пациентов с интерстициальным заболеванием легких, особенно с быстро прогрессирующим. Раннее и точное обнаружение аутоантител MDA5 жизненно важно для эффективного лечения этого тяжелого аутоиммунного заболевания.

Основное преимущество метода, который мы продемонстрировали, по сравнению с золотым методом скрининга аутоантител к MDA5 заключается в том, что это можно сделать быстрее и сэкономить время и усилия по сравнению с традиционным иммуноанализом с радиоактивными метками. Эта повышенная эффективность позволяет нам обрабатывать больше образцов и быстро получать результаты. Кроме того, важно отметить, что наш метод не только обеспечивает превосходную эффективность, но и безопасность и экономичность по сравнению с переходным иммунопреципитационным анализом.

Теперь давайте посмотрим, как это делается. Мой научный сотрудник, Тео Кай Фа, будет руководить процедурой. Поддерживайте клетки HeLa с помощью модифицированной орлиной среды Dulbecco, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% антибиотического антимикотика при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере 5% CO2.

Проходите клетки каждые два-три дня или когда клетки достигают 90-100% конфлюенции. Поместите 70 000 клеток HeLa в каждую лунку с 24-луночного планшета. За 24 часа до трансфекции и сетчатые клетки, которые примерно на 90% сливаются.

Разведите по 500 нанограмм плазмина и по 1,5 микролитра реагента для трансфекции в 25 микролитре восстановленной сыворотки среды. Добавляем разбавленную ДНК, делаем разбавленный реагент для трансфекции в соотношении один к одному. Хорошо перемешайте и выдержите пять минут.

Добавьте смесь к клеткам, сидящим за день до этого, и взбалтывайте, чтобы немедленно смешать липидный комплекс ДНК. Убедитесь, что клетки сливаются на 80–90%. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия во увлажненном полушарии с 5% CO2 в течение 40-40 часов и приступайте к иммуноцитохимии.

Мы используем коммерчески доступный фактор. Более подробную информацию можно найти в таблице материалов. Их эффективность при трансфекции составляет 50%.Успех трансфекции и экспрессия целевого белка могут быть определены путем трансфекции клеток плазмидой, экспрессирующей замороженный белок, и проведения западной крови для визуализации экспрессии целевого белка После инкубации дважды промойте клетки PBS для удаления любых оставшихся сред.

Промывка может быть выполнена путем встряхивания тарелки или орбитального шейкера. Зафиксируйте клетки с помощью 4% параформальдегида в PBS Внимание. Параформальдегид токсичен.

Используйте соответствующие рекомендации по обращению. Оставьте клетки на 15 минут при комнатной температуре. Далее утилизируйте фиксирующий реагент.

Используйте PBS для промывки камеры дважды. Нанесите реагент Triton и дайте клеткам постоять 10 минут при комнатной температуре. Мы использовали Triton X 400 в PBS в концентрации 0,3%Через 10 минут утилизируйте реагент Triton.

Добавьте PBS, чтобы промыть клетки один раз. Следующим шагом выполните блокирование 10% фетальной сывороткой крупного рогатого скота в PBS и оставьте клетки на час при комнатной температуре, Удалите блокирующий реагент. Затем добавьте PBS, чтобы промыть клетки один раз.

Добавьте в клетки разведенную плазму пациента. Перед применением обязательно разбавьте плазму пациента в соотношении один к 5 000 разведения в PBS. Отрегулируйте разбавление для усиления сигнала или уменьшения фона по мере необходимости, чтобы обеспечить несмещенные результаты.

Персонал, проводивший тест, не знал, какие образцы принадлежали пациентам, а какие — здоровым людям. Инкубируйте образец при температуре четыре градуса Цельсия в течение 12-16 часов. По истечении инкубационного периода извлеките образец пациента и трижды промойте клетки PBS.

Обрабатывайте клетки разведенным хреном, конъюгированным с пероксидазой хрена, античеловеческим IgG в соотношении один к 250 в разведении PBS. Оставьте клетки на час при комнатной температуре. Через час утилизируйте вторичное антитело.

Промойте PBS три раза. После промывки ячеек окрасьте ячейки 300 микролитрами рабочего раствора DAB на лунку. Рабочий раствор DAB готовится из отсутствующего концентрата продвижения DAB и разбавителя DAB в соответствии с инструкциями производителя.

После окрашивания клетки в течение пяти минут удалите краситель. После удаления красителя смойте ионизированной дистиллированной водой и встряхивайте в течение пяти минут. Противозаправьте ядро клетки разведенным гематоксином.

Мы используем гемотоксин в 10 раз разведения. Подождите пять минут для процесса окрашивания. Через пять минут утилизируйте гемотоксин, затем промойте проанализированной дистиллированной водой дважды по пять минут каждый.

Заключительный этап, наблюдайте за результатами окрашивания под оптическим микроскопом. Давайте интерпретируем результаты нашего иммуноцитохимического анализа на наличие аутоантител к MDA5. Положительный результат.

Истинный положительный результат показывает сильное коричневое окрашивание внутри HeLa, экспрессирующее MDA5. Это подтверждает наличие аутоантител к MDA5 в образце пациента. Отрицательный результат.

Отрицательный результат показывает клетки HeLa без коричневого окрашивания, что указывает на отсутствие аутоантител к MDA5. Ложноположительный результат. Важно отметить, что ложноположительный результат показывает обширное коричневое окрашивание во всех клетках, независимо от экспрессии MDA5s.

Это неспецифическое окрашивание, наблюдаемое для того, чтобы аутоиммунные состояния отличались от истинно положительных, чтобы избежать ошибочного диагноза. Наш метод предлагает более быстрый, безопасный и экономичный способ обнаружения антител к органам против MDA5. Это может значительно повлиять на результаты лечения интерстициального заболевания легких.

После просмотра этого видео вы узнаете, как выполнять процедуру иммуноцитохимии и как определить клиническую значимость в результатах теста.