Анализ активности Т-клеток человека в условиях аллогенного ко-культивирования предварительно обработанных опухолевых клеток

Опухолевые клетки изменяют иммунный фенотип во время терапии, что может повлиять на результат, поэтому целью нашего исследования является изучение взаимодействия между Т-клетками и опухолевыми клетками для лучшего понимания этих взаимодействий.

Повышение радиочувствительности, особенно при радиорезистентных опухолях, путем сочетания лучевой терапии с ингибиторами киназы. Нацеливание на реакцию на повреждение ДНК в настоящее время является центральной частью последних разработок. В настоящее время в области радиобиологии созданы трехмерные модели клеточных культур и модели кокультур для повышения сопоставимости между данными in vitro и in vivo.

[Рассказчик] Для начала необходимо получить опухолевые клетки HSC4 в подходящем объеме среды D10. Засейте не менее трех лунок на каждое условие, каждая из которых содержит 15 000 клеток в 200 микролитрах среды в 96 луночных планшетах. Назначьте одну пластину для обработки образца, включая лунки для контроля только опухолевых клеток и только Т-клеток, а также лунки для подсчета клеток для каждого лечения в день совместного культивирования. На второй день обрабатывайте опухолевые клетки ингибиторами киназы в необходимых концентрациях. Облучайте одну пластину через три-четыре часа и столько же через 24 часа инкубации пятью серыми для гипофракционированного облучения. Для выделения мононуклеарных клеток периферической крови или PBMC переведите смешанную кровь ЭДТА, собранную у здорового донора, в две центрифугирующие пробирки объемом 50 миллилитров. Заполните обе центрифугирующие пробирки объемом до 50 миллилитров PBS и 2% FBS. Далее подготовьте шесть центрифугирующих пробирок с пластиковыми вставками для разделения PBMC. Заполните каждый по 15 миллилитров градиентной среды холодной плотности. Тщательно посыпьте градиент плотности среды от 12 до 15 миллилитров разбавленной крови. Центрифугируйте пробирки при 1 200 G в течение 10 минут без замедления. После центрифугирования переложите надосадочную жидкость в четыре новые центрифугирующие пробирки объемом 50 миллилитров. Выбросьте использованные трубки. Наполните новые центрифугирующие пробирки объемом до 50 миллилитров PBS и 2% FBS и центрифугируйте при 120 G в течение 10 минут при комнатной температуре. Аккуратно выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре PBS, содержащем 2% FBS, и соедините две гранулы в одну соколиную пробирку. Снова заполните центрифужную пробирку до 50 миллилитров PBS, содержащим 2% FBS. Центрифугируйте PBMC при 300 G в течение 10 минут. Аккуратно выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 80 микролитрах MACS плюс буфер на 10 в степени семи клеток. Добавьте 20 микролитров микрогранул CD8 на 10 в силу семи клеток и тщательно перемешайте пипетированием вверх и вниз. Выдерживать в течение 15 минут при температуре четыре градуса Цельсия. После инкубации промойте клетки двумя миллилитрами MACS плюс буфер на 10 до степени семи клеток. Центрифугируйте пробирку при 300 G в течение 10 минут при комнатной температуре. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте клетки в 1000 микролитрах MACS плюс буфер. Установите в магнит две колонки MS и поместите под них две центрифуговые пробирки объемом 15 миллилитров. Уравновесьте колонки 500 микролитрами MACS плюс буфер. Затем загрузите равный объем суспензии ячейки в подготовленную колонку МС. Промойте колонки 500 микролитрами MACS плюс буфер три раза. Пометьте окончательные собранные клетки как проточные или CD8 отрицательные и объедините их в одну центрифужную пробирку. Затем возьмите новую центрифугирующую пробирку объемом 15 миллилитров, помеченную CD8-положительными Т-клетками. Промойте обе колонки, содержащие магнитно меченые CD8-положительные Т-клетки, 1000 микролитров MACS плюс буфер каждая. Перед окрашиванием Т-клеток центрифугируйте их при 300 G в течение пяти минут. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1000 микролитров PBS. Снова центрифугируйте суспензию при 300 G в течение пяти минут. После отбрасывания надосадочной жидкости повторно суспендировать клеточную гранулу в 2000 микролитрах одного микромолярного окрашивающего раствора CFSE. Выдерживать в течение 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем центрифугируйте окрашенные клетки при 300 G в течение пяти минут. После промывания клеток PBS повторно суспендируйте их в Т-клеточной среде. Засейте клетки в шестилуночный планшет, покрытый CD3 и CD28, и инкубируйте. На четвертый день соберите Т-клетки и ресуспендируйте их в соответствующей среде. Добавьте нужное количество Т-клеток в лунки опухолевых клеток в соотношении один к одному после подсчета обозначенных лунок. На седьмой день извлеките планшет с культурой из инкубатора для количественной оценки пролиферации Т-клеток. После промывки клеток окрасьте их нужными антителами и проведите проточную цитометрию для оценки уровня Т-клеток. Исключите заполнение дублетов на основе зависимости площади прямого рассеяния от высоты прямого рассеяния для получения синглетов. Нанесите на график синглеты для идентификации Т-клеток на основе области прямого рассеяния по сравнению с областью бокового рассеяния. Нанесите график экспрессии CD3 относительно боковой области рассеяния для различения Т-клеток. Кроме того, определите CD8-положительные Т-клетки после построения графика сигнала CD8 относительно боковой области рассеяния. Все Т-клетки должны экспрессировать CD3 и CD8. Отобразите сигнал CFSE всех CD8-положительных Т-клеток в виде гистограммы. После завершения этапов стробирования выберите CD8-положительные Т-клетки в качестве входных данных и проанализируйте их экспрессию изотипа CD25 или HLA-DR, построив график флуоресценции соответствующего поверхностного маркера относительно боковой области рассеяния. Доля пролиферативных Т-клеток увеличивалась при совместном культивировании с облученными опухолевыми клетками HSC4. Лучевая терапия или ЛТ и ЛТ плюс ингибирование ПТР значительно усиливали пролиферацию Т-клеток по сравнению с ЛТ плюс ингибирование АТМ. Среди высокопролиферативных Т-клеток ингибирование ОТ плюс ПВО было наиболее эффективным в стимуляции пролиферации. Экспрессия CD25 на Т-клетках была снижена после кокультуры с опухолевыми клетками HSC4, обработанными ОТ. Предварительная обработка опухолевых клеток только ингибитором ATM значительно снижала экспрессию CD25 по сравнению с ингибитором ATR. Комбинация ОТ и ингибитора ATM приводила к увеличению экспрессии CD25 по сравнению с ОТ плюс ингибитор ATR. Совместное культивирование с клетками HSC4, предварительно обработанными ингибитором ОТ плюс АТР, еще больше увеличило экспрессию HLA-DR по сравнению с монотерапией ОТ или ингибитором ОТ плюс АТМ.