Эффективная ретровирусная трансдукция и конкурентный хоуминг для исследования GPCR-опосредованной локализации Т-клеток в различных тканевых микросредах

В нашем исследовании изучается, как GPCR влияют на транспорт и расположение иммунных клеток в различных тканевых микросредах. Используя этот протокол и другие дополнительные протоколы, наша лаборатория идентифицировала органоспецифическую ось хемоаттрактанта в тканях слизистой оболочки кишечника. Итак, теперь мы выяснили, как лимфоциты, являющиеся домом для желудка, легких, трахеи и тракта ГУ. Я представляю эффективный и улучшенный метод проверки того, как отдельные GPCR влияют на движение Т-клеток in vivo. Мы разработали надежный способ введения этих рецепторов в Т-клетки, который теперь позволяет проводить прямое параллельное сравнение в конкурентных анализах хоуминга. Теперь, когда мы знаем, как GPCR управляют Т-клетками in vivo, исследователи могут лучше связать экспрессию рецепторов с иммунной функцией. Это помогло бы исследователям в области фундаментальной иммунологии, а также терапевтических исследований. С помощью этого подхода мы теперь можем задаться вопросом, как менее известные или неописанные GPCR участвуют в направлении Т-клеток к конкретным тканям. Мы можем узнать, как передача сигналов GPCR может быть точно настроена для лечения рака или аутоиммунных заболеваний. Мы можем помочь Т-клеткам достичь нужного места в нужное время для терапевтических подходов.

[Рассказчик] Для начала, в первый день, покройте 10-сантиметровые планшеты для культивирования тканей пятью миллилитрами 50 микрограммов на миллилитр раствором поли-D-лизина, приготовленным в стерильной воде. Инкубируйте пластины при комнатной температуре в течение 45 минут, затем дважды промойте пластины стерильным PBS без кальция и магния, чтобы убедиться, что не осталось остатков. Затем отделите клетки Plat-E с помощью двух миллилитров 0,05% трипсина и 0,5 миллимоляра ЭДТА при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех минут. Чтобы убедиться в жизнеспособности клеток с помощью теста исключения трипанового синего, смешайте равный объем клеточной суспензии с раствором трипанового синего. Затем засейте 3 миллиона живых клеток в 10-сантиметровую чашку Петри для культуры тканей средой Plat-E, не содержащей антибиотиков. На второй день замените среду на клеточных культурах Plat-E 6,5 миллилитрами среды с восстановленной сывороткой. Приготовьте трансфекционную смесь в соответствии с инструкциями производителя. Для каждой пластины смешайте 45 микролитров Липофектамина 2000 с 210 микролитрами среды с восстановленной сывороткой в одной пробирке и 15 микрограммов ДНК с 235 микролитрами среды с восстановленной сывороткой в другой пробирке. Соедините содержимое пробирок путем пипетирования три-четыре раза и выдержите в течение 20 минут при комнатной температуре, чтобы облегчить образование сложного. Теперь добавьте смесь по каплям в тарелки и выдерживайте в течение 16 часов при температуре 37 градусов Цельсия. Затем покройте 24-луночные планшеты для активации Т-клеток антимышиными CD28 и CD3 в количестве 375 микролитров на лунку PBS. Инкубируйте планшеты в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия или в течение трех-четырех часов в инкубаторе, установленном при температуре четыре градуса Цельсия. На третий день с помощью поршня шприца осторожно разомните выделенные селезенки мышей на 100-микрометровом сетчатом сетчатом фильтре, помещенном в шестилуночный планшет, содержащий среду RPMI. Перенесите клеточную суспензию через нейлоновое сетчатое сетчатое сетчатое сетчатое сетчатое фильтр толщиной 40 микрометров в 50-миллилитровую коническую трубку, чтобы получить одноклеточную суспензию. Центрифугируйте раствор при 450г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Затем промойте клетки PBS без кальция и магния. Далее выполните отбор магнитных негативов с помощью набора для выделения CD4 Т-клетки мыши в соответствии с инструкциями производителя. Подсчитайте выделенные Т-клетки с помощью счетчика клеток. Тарелируйте Т-клетки в покрытых Т-клеточными активационными лунками с плотностью от одного до 1,5 миллиона клеток на лунку в одном миллилитре среды RPMI 10. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в увлажненном инкубаторе в течение 24-48 часов. На четвертый день соберите примерно 12 миллилитров вирусной надосадочной жидкости из 10-сантиметровых пластин в коническую пробирку. Замените среду в планшетах для культивирования Plat-E на 10 миллилитров среды Plat-E без антибиотиков, чтобы получить больше вирусной надосадочной жидкости для второй трансдукции на следующий день. Чтобы отфильтровать собранную вирусную надосадочную жидкость, пропустите ее через шприцевой фильтр 0,45 мкм. Добавьте восемь микрограммов на миллилитр полибрена и один к 100 разведению буфера HEPES в отфильтрованный надосадочный жидкость. Вращайте 24-луночный Т-клеточный планшет в течение семи минут при плотности 950 г. Затем тщательно соберите и сохраните надосадочную жидкость, не смещая Т-клетки. Чтобы выполнить профилактику, добавьте в каждую лунку по одному миллилитру вирусной надосадочной жидкости. Закройте пластины полиэтиленовой пленкой и вращайте пластины при температуре 1 150 г в течение четырех часов при температуре 32 градуса Цельсия. После спаривания осторожно замените среду в каждой лунке на ранее сохраненную надосадочную жидкость Т-клеток. На шестой день соберите Т-клетки из планшета в коническую пробирку и центрифугу. Промойте гранулу PBS, содержащей кальций и магний. Перенесите клетки в новую культуральную пластину, содержащую 130 единиц на миллилитр мышиного интерлейкина-2 и 10 нанограммов на миллилитр мышиного интерлейкина-7. Инкубируйте клетки в течение не менее двух дней или до тех пор, пока они не достигнут желаемого уровня роста в зависимости от количества клеток, необходимых для инъекции. На восьмой день центрифугируйте при 450 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, чтобы гранулировать клетки. Добавьте пять миллилитров Histopaque-1077 в 15-миллилитровую тубусу. Ресуспендируйте Т-клеточную гранулу в пяти миллилитрах PBS, содержащем кальций и магний. Тщательно выложите клеточную суспензию поверх пяти миллилитров Histopaque-1077 в центрифужной пробирке. Центрифугируйте образец при давлении от 400 до 500 г в течение 20 минут при комнатной температуре, следя за тем, чтобы разрыв центрифуги или ускорение были установлены на 0. После центрифугирования наблюдайте за формированием отчетливых клеточных слоев. Аккуратно соберите с помощью пипетки слой интерфейса, содержащий нужные клетки, не допуская загрязнения другими слоями. Трансдуцированные GPR25 Т-клетки продемонстрировали усиленную миграцию в сторону hCXCL17 и mCXCL17 по сравнению с контролями, трансдуцированными наполнителями, подтверждая функциональную экспрессию рецепторов. Трансдуцированные клетки GPR25 преимущественно локализованы в некишечные слизистые ткани, такие как мочеполовой тракт, желудок и трахея, при этом значительное обогащение наблюдается через семь недель, но не через неделю после инъекции. Краткосрочные анализы хоуминга показали, что GPR25 трансдуцировал Т-клетки преимущественно в органы, богатые Cxcl17, такие как трахея, желудок, язык, желчный пузырь и слизистая оболочка матки, в то время как у мышей с дефицитом Cxcl17 он не накапливался. GPR25 трансдуцировал клетки, преимущественно локализованные в бронхах, в то время как контрольные клетки чаще обнаруживались вблизи вен.