Метод 2-Фотон изображений кровотока в коре головного мозга через черепной Window

Возможность визуализировать церебральную сосудистую сеть и записывать динамику кровотока в интактном мозге живых грызунов является мощным методом, который может быть применен для изучения церебральной ишемии или нормальной физиологии мозга. Здесь мы продемонстрируем, как использовать две фотомикроскопии для визуализации динамики кровотока в неокортексе живых мышей с помощью флуоресцентных красителей, вводимых в хвостовую вену. Эта техника была первоначально разработана Дэвидом Кляйнфельдом в Winfred Dank.

Здравствуйте, меня зовут Рикардо Мота из лаборатории Карлоса Портера Кайо на кафедре неврологии Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе. В предыдущем видео мы показали вам метод имплантации краниального окна для экспериментов с хронической визуализацией in vivo. Сегодня мы покажем вам процедуру визуализации динамики кровотока в коре головного мозга через краниальное окно.

Этот препарат очень полезен, потому что позволяет получать изображения глубоко внутри мозга с помощью фотонной лазерной микроскопии. Итак, давайте начнем. Для визуализации сосудов головного мозга животным необходимо внутривенно вводить флуоресцентный краситель.

Мы используем конъюгированные красители Декстер, потому что декстрон предотвращает пересечение красителем гематоэнцефалического барьера и утечку из кровеносных сосудов. Мышей обезболивают изофтором в дозе 4% для индукции и от 1,5 до 2% во время инъекции. Далее хвост дезинфицируется тремя тампонами из 70% спирта иглой 26 калибра, через хвостовую вену вводится от 75 до ста микролитров 5% раствора R domine Dexcan, растворенного в физрастворе.

Примерно через два часа после инъекции флуоресцентного красителя Декстера мышь обезболивают изофтором. Опять же, 4% для индукции, от одного до 1,5% для визуализации. Мышь прочно прикреплена с помощью титанового стержня к предметному столику микроскопа, который содержит терморегулируемую грелку для сохранения тепла животного.

Для увлажнения глаз наносится немного глазной мази. Покровное стекло краниального окна очищают 70%-ным спиртом. Окно располагается параллельно фокальной плоскости и центрируется в поле зрения.

Под объективом «четыре х» лучше всего фотографировать сосуды поверхности мозга с помощью цифровой камеры. Это изображение будет использоваться в качестве эталонного изображения в последующих сеансах визуализации для многократного поиска области изображения изо дня в день. Затем объектив с четырьмя x заменяется на объектив с погружением в воду 40 x.

Не перемещая сцену, делается цифровой снимок вида. Опять же, координаты манипулятора сцены установлены на нуле. Мы используем сканирование изображения в качестве программного обеспечения для получения изображений.

Об этом написали в MATLAB Том Пол Рудо и Бернардо Сабатини в лаборатории Carls Voto. Затем мы включаем все остальное оборудование: лазер, измеритель мощности, фотоумножитель, усилители и так далее. Область окна, пригодная для изображения, кратковременно сканируется при малом увеличении, чтобы найти лучшие области.

После того, как они идентифицированы, берется стек с низким увеличением выбранной области для изображения, и ее координаты XY аннотируются для записи динамики кровотока в мелких сосудах или капиллярах. Мы используем линейное сканирование по крайней мере 40 микрон интересующего сосуда. Эти одиночные развертки продолжительностью в одну секунду выполняются с использованием как можно меньшей мощности лазера, а координаты и угол сканирования записываются.

После завершения сеанса визуализации животное перемещают в теплую камеру, где оно может восстановиться после анестезии. Здесь мы показываем стопку из ста изображений, сделанных каждые пять микрон с помощью нашего двухфотонного микроскопа через краниальное окно, расположенное над соматосенсорной корой пятимесячной мыши, которой через хвостовую вену был введен r Domine dextan. Эта последовательность изображений показывает сложную сеть крупных и мелких кровеносных сосудов, включая капилляры.

Мы только что показали вам метод визуализации динамики кровотока in vivo через краниальное окно. Это чрезвычайно мощный метод визуализации динамики мозгового кровотока в корковой сосудистой сети, например, для исследования изменений кровотока после инсульта. В разное время при BUL можно сделать несколько фантазий, используя повторяющиеся инъекции флуоресцентного красителя в хвостовую вену.

При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости работать в максимально чистых и стерильных условиях и иметь очень твердую руку. Ладно, вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в проведении Вашего эксперимента.